Multilevel balancing of laccase biosynthesis and secretion in Bacillus subtilis enables efficient tobacco straw delignification

يولد المزارعون ومعالجو الأغذية كميات هائلة من النفايات النباتية كل عام، من سيقان الذرة إلى القش المتبقي بعد حصاد التبغ. هذه المواد محملة بالسكريات التي يمكن تحويلها إلى وقود أو مواد كيميائية مفيدة، لكن الطبيعة بنت حولها درعاً عنيداً. فداخل جدار الخلية النباتية، تُحبس السكريات خلف حاجز صلب ومتشابك مصنوع من اللجنين، وهي مادة معقدة تمنح الخشب صلابته. وللوصول إلى السكريات القيمة في الداخل، يجب على العلماء أولاً كسر درع اللجنين هذا. ومن الطرق الواعدة للقيام بذلك هي استخدام إنزيم يسمى "لاكاز" (laccase)، والذي يعمل كأداة متخصصة يمكنها النحت في بنية اللجنين دون إتلاف السكريات الموجودة تحتها. ومع ذلك، كان إنتاج ما يكفي من هذا الإنزيم ليكون مفيداً على نطاق واسل أمراً صعباً؛ فالفطريات، المنتجة الطبيعية للاكاز، تنمو ببطء ويصعب التحكم بها في المختبر، بينما تجد أنواع أخرى من البكتيريا الشائعة صعوبة في إفراز الإنزيم خارج خلاياها حيث يمكنه القيام بعمله.

سعى باحثون من جامعة ليني (Linyi University) ومؤسسات أخرى عديدة لحل هذه المشكلة عن طريق تحويل نوع شائع من بكتيريا التربة، وهي "العصوية الرقيقة" (Bacillus subtilis)، إلى مصنع عالي الكفاءة لإنتاج اللاكاز. وتشتهر هذه البكتة بقدرتها على النمو بسهولة وقدرتها على دفع البروتينات إلى بيئتها المحيطة. كان هدف الفريق هو ضبط الآلات الداخلية للبكتيريا بدقة لتنتج الإنزيم بكميات هائلة وتطلقه مباشرة في الوسط السائل. بدأوا باختبار خمس نسخ مختلفة من جين اللاكاز من مصادر متنوعة، بما في ذلك الفطريات وبكتيريا أخرى، لمعرفة أي منها سيعمل بشكل أفضل داخل هذا المضيف المحدد. ووجدوا أن نسخة من الإنزيم موجودة طبيعياً في "العصوية الرقيقة" نفسها كانت الأفضل أداءً، ولكن فقط عندما يكون المضيف نوعاً معيناً من البكتيريا تم تعديله وراثياً بحيث يفتقر إلى بعض الإنزيمات التي قد تلتهم هذا البروتين الجديد.

ولكي تجعل البكتيريا تنتج المزيد من الإنزيم، تصرف العلماء كمهندسين يقومون بضبط إعدادات آلة معقدة. أولاً، قاموا باستبدال "المفتاح الجيني" الذي يشغل الجين بمحفز يستجيب للمالتوز، وهو نوع من السكر، مما سمح لهم بالتحكم بدقة في الوقت الذي تبدأ فيه البتكريا بالعمل. بعد ذلك، عالجوا مشكلة رئيسية، وهي أن الإنزيم كان يعلق داخل الخلية البكتيرية؛ وبما أن النسخة الطبيعية من الإنزيم تفتقر إلى علامة محددة لتوجيهه للخارج، قام الفريق بإرفاق واحدة من ثمانية "ملصقات شحن" مختلفة، تُعرف باسم الببتيدات الإشارية، في مقدمة الإنزيم. واختبروا كل ملصق لمعرفة أيهما يساعد الإنزيم على الخروج من الخلية بكفاءة أكبر، ليجدوا في النهاية ملصقاً عزز بشكل كبير كمية الإنزيم المنطلق في السائل. وأخيراً، قاموا بضبط "زر البدء" لصنع البروتين، المعروف باسم موقع ربط الريبوسوم، لضمان أن تعمل آلات صنع البروتين في الخلية بالسرعة المثالية؛ ليست سريعة جداً بحيث تسد النظام، ولكن سريعة بما يكفي لتعظيم الإنتاج.

كانت النتيجة هي عملية ضبط متعددة الخطوات أنتجت سلالة بكتيرية محسنة للغاية يمكنها إنتاج كمية استثنائية من اللاكاز. فعندما قام الباحثون بزراعة هذه البكتيريا في خزان كبير سعة ثلاثة لترات مع تغذيتها بالعناصر الغذائية بعناية، نمت الثقافة لتصل إلى كثافة هائلة، ووصل نشاط الإنزيم في السائل إلى ذروة بلغت 6,339.61 وحدة لكل لتر. وكان هذا تحسناً كبيراً مقارنة بالمحاولات السابقة. ولإثبات أن هذا الإنزيم عالي الحجم مفيد حقاً، أخذ الفريق السائل الخام الذي يحتوي على الإنزيم وطبقه على قش التبغ الحقيقي. وبعد أربع وأربعين ساعة من المعالجة، انخفض محتوى اللجنين في القش بنسبة تقارب الثلاثين بالمائة، حيث انخفض من حوالي 80.7 مليجرام لكل جرام إلى 56.8 مليجرام لكل جرام.

أكدت التغييرات الفيزيائية في القش أن الإنزيم كان يقوم بما هو مقصود منه تماماً. فبموجب المجهر، بدا السطح الأملس والمتراص للقش غير المعالج كأنه ورقة صلبة غير منقطعة، أما بعد المعالجة بالإنزيم، أصبح السطح خشناً، ومتصدعاً، وفضفاضاً، مما أظهر أن حاجز اللجنين الواقي قد تم تفكيكه بنجاح. كما كشف التحليل الكيميائي أيضاً أن الإنزيم قد استهدف الروابط الكيميائية المحددة في اللجنين، حيث قام بتفكيكها مع ترك مكونات السكر القيمة سليمة إلى حد كبير. توضح هذه الدراسة أنه من خلال الموازنة الدقيقة بين خطوات تنشيط الجينات، ونقل البروتين، وسرعة الإنتاج، يمكن تحويل بكتيريا بسيطة إلى أداة قوية لتفكيك النفايات الزراعية. ويقدم هذا النهج مساراً قابلاً للتوسع وفعالاً لتحويل المواد النباتية الصلبة إلى موارد متجددة، مما قد يجعل عملية إنتاج الوقود الحيوي أكثر استدامة وجدوى اقتصادية.