Multilevel balancing of laccase biosynthesis and secretion in Bacillus subtilis enables efficient tobacco straw delignification

농부와 식품 가공업자들은 매년 옥수수 대에서부터 담배 수확 후 남은 짚에 이르기까지 막대한 양의 식물성 폐기물을 발생시킵니다. 이 물질에는 연료나 유용한 화학 물질로 전환될 수 있는 당분이 가득하지만, 자연은 그 주변에 완고한 방패를 구축해 두었습니다. 식물 세포벽 내부에서 당분은 나무에 강성을 부여하는 복합 물질인 리그닌으로 이루어진 단단하고 교차 결합된 장벽 뒤에 갇혀 있습니다. 내부의 가치 있는 당분에 접근하기 위해 과학자들은 먼저 이 리그닌 방패를 깨뜨려야 합니다. 이를 수행하는 유망한 방법 중 하나는 라카아제(laccase)라고 불리는 효소를 사용하는 것인데, 이는 라카아제가 아래의 당분을 손상시키지 않으면서 리그닌 구조를 깎아낼 수 있는 특화된 도구처럼 작용하게 합니다. 그러나 대규모로 유용하게 사용할 만큼 충분한 양의 이 효소를 생산하는 것은 어려웠습니다. 라카아제의 천연 생산자인 균류는 느리게 성장하고 실험실에서 조작하기 까다로운 반면, 다른 흔한 박테리아들은 효소가 제 역할을 할 수 있도록 세포 밖으로 분비하는 데 어려움을 겪습니다.

린이 대학교(Linyi University)와 여러 다른 기관의 연구진은 흔한 토양 박테리아인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 라카아제를 만드는 고효율 공장으로 탈바 바꿈으로써 이 문제를 해결하고자 했습니다. 이 박테리아는 이미 키우기 쉽고 단백질을 주변 환경으로 밀어내는 능력이 있는 것으로 알려져 있습니다. 연구팀의 목표는 박테리아의 내부 기계를 미세 조정하여 효소를 대량으로 생산하고 이를 액체 배양액 속으로 직접 방출하도록 하는 것이었습니다. 그들은 먼저 곰팡이와 다른 박테리아를 포함한 다양한 출처의 다섯 가지 서로 다른 라카아제 유전자 버전을 테스트하여, 이 특정 숙주 내에서 어떤 것이 가장 잘 작동하는지 확인했습니다. 그들은 Bacillus subtilis 자체에서 발견되는 효소 버전이 가장 성능이 좋다는 것을 발견했는데, 다만 해당 숙주 박테리아가 새로운 단백질을 갉아먹을 수 있는 특정 효소가 결핍되도록 유전적으로 변형된 특정 균주일 때만 그러했습니다.

박테리아가 더 많은 효소를 생산하도록 만들기 위해, 과학자들은 복잡한 기계의 설정을 조정하는 엔지니어처럼 행동했습니다. 먼저, 그들은 유전자를 켜는 유전적 '스위치'를 교체하여 말토스(maltose, 일종의 당)에 반응하는 프로모터로 바꾸었습니다. 이를 통해 그들은 박테리아가 작업을 시작하는 시점을 정확하게 제어할 수 있었습니다. 다음으로, 그들은 주요 병목 현상인 효소가 박테리아 세포 내부에 갇히는 문제를 해결했습니다. 천연 버전의 효소에는 외부로 안내할 특정 태그가 부족했기 때문에, 연구팀은 효소의 앞부분에 8가지 서로 다른 '배송 라벨'인 신호 서열(signal peptides) 중 하나를 부착했습니다. 그들은 각 라벨을 테스트하여 어떤 라벨이 효소의 세포 탈출을 가장 효율적으로 돕는지 확인했으며, 결국 액체 속으로 방출되는 효소의 양을 크게 높여주는 라벨 하나를 찾아냈습니다. 마지막으로, 그들은 단백질 제조의 '시작 버튼'인 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site)를 조정하여, 세포의 단백질 제조 기계가 시스템을 막을 정도로 너무 빠르지도 않으면서 출력을 극대화할 수 있을 만큼 충분히 빠르게 작동하도록 했습니다.

이러한 다단계 튜닝의 결과로, 엄청난 양의 라카아제를 생산할 수 있는 고도로 최적화된 박테리아 균주가 탄생했습니다. 연구진이 이 박테리아를 3리터 규모의 대형 탱크에서 키우며 영양분을 세심하게 공급했을 때, 배양액은 거대한 밀도에 도달했고 액체 내 효소 활성은 리터당 6,339.61 유닛이라는 정점에 도달했습니다. 이는 이전의 시도들에 비해 극적인 개선이었습니다. 이 고용량 효소가 실제로 유용한지를 증명하기 위해, 연구팀은 효소가 포함된 조액(crude liquid)을 실제 담배 짚에 적용했습니다. 48시간의 처리 후, 짚의 리그닌 함량은 약 80.7 mg/g에서 56.8 mg/g으로 거의 30% 감소했습니다.

짚의 물리적 변화는 효소가 의도한 대로 정확히 작동했음을 확인시켜 주었습니다. 현미경 아래에서, 처리되지 않은 짚의 매끄럽고 빽빽하게 채워진 표면은 하나의 단단하고 끊어지지 않는 시트처럼 보였습니다. 효소 처리 후, 표면은 거칠고 균열이 생기며 느슨해졌는데, 이는 보호막 역할을 하는 리그닌 장벽이 성공적으로 해체되었음을 보여줍니다. 화학적 분석 또한 효소가 가치 있는 당 성분은 거의 온전히 남겨둔 채 리그닌의 특정 화학 결합을 표적으로 삼아 분해했음을 밝혀냈습니다. 이 연구는 유전자 활성화, 단백질 운반, 그리고 생산 속도의 단계를 정밀하게 균형 잡음으로써, 단순한 박테리아를 강력한 폐기물 분해 도구로 바꿀 수 있음을 입증합니다. 이 접근 방식은 견고한 식물 재료를 재생 가능한 자원으로 전환하는 확장 가능하고 효율적인 경로를 제시하며, 잠재적으로 바이오 연료 생산을 더욱 지속 가능하고 경제적으로 실행 가능하게 만듭니다.