Multilevel balancing of laccase biosynthesis and secretion in Bacillus subtilis enables efficient tobacco straw delignification
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि *बैसिलस सबटिलिस* (Bacillus subtilis) में एक बहुस्तरीय इंजीनियरिंग रणनीति, जिसमें ट्रांसक्रिप्शन, ट्रांसलेशन और स्राव संकेतों का अनुकूलन शामिल है, तंबाकू के भूसे के कुशल जैविक डिलिग्निफिकेशन (delignification) को प्राप्त करने के लिए बाह्यकोशिकीय लैकेज़ (extracellular laccase) के उत्पादन को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है।
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किसान और खाद्य प्रसंस्करणकर्ता हर साल पौधों के कचरे की भारी मात्रा उत्पन्न करते हैं, जिसमें मक्के के डंठल से लेकर तंबाकू की कटाई के बाद छोड़ी गई भूसी तक शामिल है। यह सामग्री शर्करा (शुगर) से भरपूर होती है जिसे ईंधन या उपयोगी रसायनों में बदला जा सकता है, लेकिन प्रकृति ने इनके चारों ओर एक जिद्दी ढाल बना दी है। पादप कोशिका भित्ति के भीतर, शर्करा को लिग्निन से बनी एक कठोर, क्रॉस-लिंक्ड बाधा के पीछे बंद कर दिया गया है, जो एक जटिल पदार्थ है जो लकड़ी को उसकी मजबूती प्रदान करता है। इसके भीतर की मूल्यवान शर्करा तक पहुँचने के लिए, वैज्ञानिकों को पहले इस लिग्निन ढाल को तोड़ना होगा। इसे करने का एक आशाजनक तरीका लैसेस (laccase) नामक एंजाइम का उपयोग करना है, जो एक विशेष उपकरण की तरह कार्य करता है जो नीचे की शर्करा को नुकसान पहुँचाए बिना लिग्निन की संरचना को छील सकता है। हालाँकि, बड़े पैमाने पर उपयोगी होने के लिए इस एंजाइम का पर्याप्त उत्पादन करना कठिन रहा है। कवक (फंगी), जो लैसेस के प्राकृतिक उत्पादक हैं, धीरे बढ़ते हैं और उन्हें प्रयोगशाला में हेरफेर करना कठिन होता है, जबकि अन्य सामान्य बैक्टीरिया इस एंजाइम को अपने सेल से बाहर निकालने में संघर्ष करते हैं जहाँ यह अपना काम कर सके।
लिनयी विश्वविद्यालय और कई अन्य संस्थानों के शोधकर्ताओं ने एक सामान्य मृदा जीवाणु (सॉइल बैक्टीरिया), बैसिलस सबटिलिस (Bacillus subtilis) को लैसेस बनाने के लिए एक उच्च-दक्षता वाले कारखाने में बदलकर इस समस्या को हल करने का प्रयास किया। यह जीवाणु पहले से ही आसानी से उगाने और अपने प्रोटीनों को अपने आसपास के वातावरण में धकेलने की अपनी क्षमता के लिए जाना जाता है। टीम का लक्ष्य जीवाणु की आंतरिक मशीनरी को इस तरह से ट्यून करना था ताकि वह भारी मात्रा में एंजाइम का उत्पादन करे और उसे सीधे तरल कल्चर में छोड़ दे। उन्होंने विभिन्न स्रोतों, जिनमें कवक और अन्य बैक्टीरिया शामिल हैं, से लैसेस जीन के पांच अलग-अलग संस्करणों का परीक्षण करना शुरू किया, यह देखने के लिए कि इस विशिष्ट होस्ट के भीतर कौन सा सबसे अच्छा काम करता है। उन्होंने पाया कि एक संस्करण, जो स्वयं बैसिलस सबटिलिस में स्वाभाविक रूप से पाया जाता है, सबसे अच्छा प्रदर्शन करता है, लेकिन केवल तभी जब होस्ट जीवाणु एक विशिष्ट स्ट्रेन हो जिसे आनुवंशिक रूप से उन एंजाइमों की कमी के लिए संशोधित किया गया था जो अन्यथा नए प्रोटीन को नष्ट कर देते।
एंजाइम का अधिक उत्पादन करने के लिए, वैज्ञानिकों ने एक जटिल मशीन की सेटिंग्स को समायोजित करने वाले इंजीनियरों की तरह कार्य किया। सबसे पहले, उन्होंने जीन को चालू करने वाले आनुवंशिक "स्विच" को बदल दिया, और इसे माल्टोज (एक प्रकार की चीनी) के प्रति प्रतिक्रिया देने वाले प्रमोटर से बदल दिया। इसने उन्हें यह नियंत्रित करने की अनुमति दी कि बैक्टीरिया ने काम शुरू कब किया। इसके बाद, उन्होंने एक प्रमुख बाधा को संबोधित किया: एंजाइम कोशिका के अंदर फंस रहा था। चूंकि एंजाइम का प्राकृतिक संस्करण में उसे बाहर जाने के लिए निर्देशित करने वाले किसी विशिष्ट टैग की कमी थी, इसलिए टीम ने एंजाइम के सामने आठ अलग-अलग "शिपिंग लेबल", जिन्हें सिग्नल पेप्टाइड्स कहा जाता है, में से एक को जोड़ा। उन्होंने प्रत्येक लेबल का परीक्षण किया कि कौन सा लेबल एंजाइम को कोशिका से सबसे कुशलता से बाहर निकलने में मदद करता है, और अंततः एक ऐसा लेबल खोज निकाला जिसने तरल में जारी किए गए एंजाइम की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि की। अंत में, उन्होंने प्रोटीन बनाने के "स्टार्ट बटन" को समायोजित किया, जिसे राइबोसोम-बाइंडिंग साइट कहा जाता है, ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिका की प्रोटीन बनाने वाली मशीनरी बिल्कुल सही गति से काम करे—इतनी तेज़ नहीं कि सिस्टम जाम हो जाए, बल्कि इतनी तेज़ कि आउटपुट को अधिकतम किया जा सके।
इस बहु-चरणीय ट्यूनिंग का परिणाम बैक्टीरिया का एक अत्यधिक अनुकूलित स्ट्रेन था जो लैसेस की असाधारण मात्रा का उत्पादन कर सकता था। जब शोधकर्ताओं ने इन बैक्टीरिया को एक बड़े, तीन-लीटर के टैंक में उगाया और उन्हें सावधानीपूर्वक पोषक तत्व खिलाए, तो कल्चर एक विशाल घनत्व तक बढ़ गया और तरल में एंजाइम की गतिविधि 6,339.61 यूनिट प्रति लीटर के शिखर पर पहुँच गई। यह पिछले प्रयासों की तुलना में एक नाटकीय सुधार था। यह साबित करने के लिए कि यह उच्च-मात्रा वाला एंजाइम वास्तव में उपयोगी है, टीम ने एंजाइम युक्त कच्चे तरल को वास्तविक तंबाकू भूसी पर लागू किया। अड़तालीस घंटों के उपचार के बाद, भूसी में लिग्निन की मात्रा लगभग तीस प्रतिशत गिर गई, जो लगभग 80.7 मिलीग्राम प्रति ग्राम से गिरकर 56.8 मिलीग्राम प्रति ग्राम हो गई।
भूसी में हुए भौतिक परिवर्तनों ने पुष्टि की कि एंजाइम ठीक वही कर रहा था जो इरादा था। सूक्ष्मदर्शी के नीचे, अनुपचारित भूसी की चिकनी, कसकर पैक की गई सतह एक ठोस, अखंड शीट की तरह दिखाई देती थी। एंजाइम उपचार के बाद, सतह खुरदरी, खंडित और ढीली हो गई, जिससे पता चला कि सुरक्षात्मक लिग्निन बाधा को सफलतापूर्वक ध्वस्त कर दिया गया है। रासायनिक विश्लेषण ने आगे खुलासा किया कि एंजाइम ने लिग्निन में विशिष्ट रासायनिक बंधों को लक्षित किया, उन्हें तोड़ दिया जबकि मूल्यवान शर्करा घटकों को काफी हद तक बरकरार रखा। यह अध्ययन दर्शाता है कि जीन सक्रियण, प्रोटीन परिवहन और उत्पादन गति के चरणों को सावधानीपूर्वक संतुलित करके, एक साधारण जीवाणु को कृषि अपशिष्ट को तोड़ने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण में बदलना संभव है। यह दृष्टिकोण कृषि अपशिष्ट को नवीकरणीय संसाधनों में बदलने के लिए एक स्केलेबल और कुशल मार्ग प्रदान करता है, जो संभावित रूप से बायोफ्यूल उत्पादन की प्रक्रिया को अधिक टिकाऊ और आर्थिक रूप से व्यवहार्य बना सकता है।
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