Epigenetic silence of C1RL-AS1 by Adriamycin inhibits PD-L1 expression via suppression of miR-3150a-3p/IFNAR2 and JAK1/STAT1 signaling pathway in breast cancer

Technische Zusammenfassung: Epigenetisches Silencing von C1RL-AS1 durch Adriamycin bei Brustkrebs

Problemstellung
Adriamycin-Resistenz (Doxorubicin) bleibt ein primäres Hindernis für eine erfolgreiche Behandlung und eine Ursache für eine schlechte Prognose bei Brustkrebs, insbesondere bei Luminal-A-Subtypen. Obwohl Adriamycin ein First-Line-Zytostatikum ist, erwerben überlebende Tumorzellen oft Resistenzen durch die Modulation zellulärer Signalwege, DNA-Reparaturmechanismen und die Deregulierung der Apoptose. Die spezifischen molekularen Mechanismen, die diese Resistenz vorantreiben – insbesondere unter Beteiligung von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) und epigenetischen Modifikationen – müssen weiter aufgeklärt werden, um die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern.

Methodik
Die Studie verwendete einen facettenreichen Ansatz, der Bioinformatik, Molekularbiologie und In-vivo-Modelle kombinierte:

• Bioinformatische Analyse: Die Forscher nutzten den GSE155478-Datensatz, um nach differenziell exprimierten lncRNAs zwischen Adriamycin-resistenten (MCF-7/ADR) und parental Zellen zu suchen. Sie analysierten zudem TCGA-Datensätze und GEPIA hinsichtlich Expressionskorrelationen, Überlebensanalysen und Immuninfiltration (mittels CIBERSORT).
• Zellmodelle: Es wurden Adriamycin-resistente Zelllinien (MCF-7/ADR und ZR-75-1/ADR) etabliert. Standard-Zelllinien (MCF-7, ZR-75-1, MDA-MB-231, HBL-100) wurden für vergleichende Analysen verwendet.
• Funktionelle Assays:
  • Viabilität und Resistenz: CCK-8-Assays und Koloniebildungs-Assays wurden eingesetzt, um IC50-Werte und die Zellviabilität unter Adriamycin-Behandlung zu bestimmen.
  • Apoptose: Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Apoptoseraten zu bewerten.
  • Epigenetische Regulation: Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) wurde durchgeführt, um das Niveau der H3K27-Acetylierung am C1RL-AS1-Promotor zu analysieren. Der Histon-Acetyltransferase-Inhibitor C646 wurde zur Validierung der Rolle der Acetylierung eingesetzt.
  • Mechanistische Interaktionen: RNA-Pull-down-Assays, Luciferase-Reporter-Assays und RIP (RNA-Immunpräzipitation) wurden durchgeführt, um die Interaktionen zwischen C1RL-AS1, miR-3150a-3p und IFNAR2 zu verifizieren.
  • Proteinanalyse: Western Blotting wurde verwendet, um die Proteinspiegel von PD-L1, JAK1, STAT1 und IFNAR2 zu quantifizieren.
• In-vivo-Modelle: Xenograft-Tumore wurden in nackten Mäusen mittels MCF-7/ADR-Zellen etabliert, die mit lentiviralen Vektoren (Überexpression oder Kontrolle) transfiziert wurden, um das Tumorwachstum und die Reaktion auf die Verabreichung von Adriamycin zu überwachen.

Wesentliche Beiträge und Ergebnisse
Die Studie identifizierte C1RL-AS1 als einen kritischen Regulator der Adriamycin-Resistenz bei Brustkrebs durch folgende Erkenntnisse:

1. Epigenetisches Silencing durch Adriamycin:

   • C1RL-AS1 ist in Adriamycin-resistenten Brustkrebszellen und Luminal-A-Brustkrebsgeweben im Vergleich zu angrenzendem Normalgewebe signifikant herunterreguliert.
   • Eine hohe Expression von C1RL-AS1 korreliert mit einem besseren Überleben bei HER2-negativen Patientinnen.
   • Mechanistisch gesehen reduziert die Adriamycin-Behandlung die H3K27-Acetylierung in der C1RL-AS1-Promotorregion. Diese epigenetische Modifikation führt zu einem transkriptionellen Silencing von C1RL-AS1. Die Behandlung mit dem HAT-Inhibitor C646 imitierte diese Herunterregulierung und bestätigte die Rolle von H3K27ac.

2. Wiederherstellung der Sensitivität durch C1RL-AS1-Überexpression:

   • Die Überexpression von C1RL-AS1 in resistenten Zellen (MCF-7/ADR, ZR-75-1/ADR) reduzierte die Zellviabilität signifikant, verringerte die Koloniebildung und senkte die IC50-Werte für Adriamycin.
   • In Xenograft-Modellen verlangsamte die C1RL-AS1-Überexpression das Tumorwachstum und verstärkte den hemmenden Effekt von Adriamycin im Vergleich zu den Kontrollen. Umgekehrt erhöhte der Knockdown von C1RL-AS1 in sensitiven Zellen die Viabilität und die Resistenz.

3. Die ceRNA-Achse: C1RL-AS1 / miR-3150a-3p / IFNAR2:

   • C1RL-AS1 fungiert als eine konkurrierende endogene RNA (ceRNA), die miR-3150a-3p direkt „sponged“ (absorbiert).
   • miR-3150a-3p ist in Adriamycin-resistenten Zellen und Brustkrebsgeweben hochreguliert. Sein Knockdown sensibilisiert resistente Zellen gegenüber Adriamycin.
   • C1RL-AS1-Überexpression inhibiert die Expression von miR-3150a-3p, während ein Knockdown von C1RL-AS1 die Expression von miR-3150a-3p fördert.
   • miR-3150a-3p targetiert und reguliert IFNAR2 (Interferon-Alpha-Rezeptor 2) direkt negativ. Folglich verhindert C1RL-AS1 durch das Sponging von miR-3150a-3p die durch miR-3150a-3p vermittelte Repression der IFNAR2-Expression.

4. Aktivierung der JAK1/STAT1- und PD-L1-Expression:

   • Die Wiederherstellung der IFNAR2-Expression aktiviert den JAK1/STAT1-Signalweg.
   • Die Aktivierung dieses Signalwegs fördert die Transkription von PD-L1.
   • Die Studie zeigt, dass ein C1RL-AS1-Knockdown die PD-L1-Expression reduziert; dieser Effekt wird durch die Inhibition von miR-3150a-3p umgekehrt, aber aufgehoben, wenn gleichzeitig IFNAR2 ausgeschaltet wird.
   • Eine niedrigere IFNAR2-Expression bei Patientinnen korreliert mit einer reduzierten Infiltration durch Immunzellen, was darauf hindeutet, dass C1RL-AS1 das immunologische Mikromilieu des Tumors beeinflusst.

Bedeutung
Die Arbeit postuliert, dass das epigenetische Silencing von C1RL-AS1 durch Adriamycin ein Schlüsselmechanismus ist, der die Chemoresistenz bei Brustkrebs vorantreibt. Durch die Unterdrückung der H3K27-Acetylierung führt Adriamycin unbeabsichtigt zu einer Herunterregulierung von C1RL-AS1, was wiederum dazu führt, dass miR-3150a-3p nicht mehr ausreichend gesponget wird. Dies führt zur Suppression von IFNAR2, der Inhibition des JAK1/STAT1-Signalwegs und einer reduzierten PD-L1-Expression.

Die Autoren legen nahe, dass C1RL-AS1 ein potenzielles therapeutisches Target sein könnte, um die Chemotherapieresistenz zu überwinden. Speziell könnten Strategien, die darauf abzielen, die C1RL-AS1-Expression aufrechtzuerhalten oder wiederherzustellen, resistente Tumore erneut für Adriamycin sensibilisieren. Angesichts der Verbindung zwischen C1RL-AS1, PD-L1 und der Immuninfiltration impliziert die Studie zudem, dass der C1RL-AS1-Status relevant für das Verständnis des immunologischen Mikromilieus des Tumors sein könnte und potenziell die Kombinationstherapien bestehend aus Immuntherapie und Chemotherapie leiten kann. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass die Identifizierung dieser molekularen Mechanismen entscheidend ist, um die klinischen Behandlungsergebnisse und die Prognose für Brustkrebspatientinnen zu verbessern.