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Breeding of high-yield low-temperature lipase fungi, optimization of fermentation conditions and isolation and purification of lipase

Diese Studie hat erfolgreich einen hochertragreichen *Aspergillus niger*-Mutanten durch Mutagenese und Fermentationsoptimierung gezüchtet, um eine gereinigte Lipase für niedrige Temperaturen mit überlegener katalytischer Aktivität bei 15 °C zu produzieren, was eine kosteneffiziente Lösung für energieeffiziente industrielle Anwendungen bietet.

Ursprüngliche Autoren: Lutong Yang, Mengai Wang, Hongyan Fu, Yun Zhang, Yu Zhang, Mengni Cui, Bowen Jiang, Hong Chen, Yanwei Cui

Veröffentlicht 2026-06-29

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CC BY 4.0

Ursprüngliche Autoren: Lutong Yang, Mengai Wang, Hongyan Fu, Yun Zhang, Yu Zhang, Mengni Cui, Bowen Jiang, Hong Chen, Yanwei Cui

Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). ⚕️ Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen

Das große Ganze: Die Suche nach einem „Kälte-Arbeiter“

Stellen Sie sich vor, Sie haben eine Fabrik, die arbeiten muss, aber das Gebäude ist eiskalt. Die meisten Arbeiter (Enzyme) sind wie Menschen: Wenn es zu kalt ist, werden sie langsam, zittern und arbeiten nicht mehr effizient. Sie brauchen eine Heizung, um in Schwung zu kommen.

In dieser Forschungsarbeit geht es darum, einen speziellen „Arbeiter“ (einen Pilz) zu finden und zu trainieren, der die Kälte liebt. Das Team wollte eine Niedrigtemperatur-Lipase erschaffen. Stellen Sie sich die Lipase als eine Art molekulare Schere vor, die Fette (wie Fett oder Öl) zerschneidet. Normalerweise funktionieren diese Scheren nur gut in heißem Wasser. Die Wissenschaftler wollten Scheren, die selbst in einer kalten Spüle Fett wegschneiden können, was Energie spart, da man das Wasser nicht aufheizen müsste.

Schritt 1: Die Schatzsuche (Screening)

Die Forscher begaben sich in den Daxing’anling-Wald in Heilongjiang, China. Dies ist ein Ort, an dem der Winter mit -52 °C extrem brutal ist. Sie gruben Bodenproben aus, in der Hoffnung, einen Pilz zu finden, der sich bereits an diese extreme Kälte angepasst hat.

Die Analogie: Stellen Sie sich vor, man sucht nach einem Fisch, der in einem Eiswürfel überleben kann. Sie nahmen Erde, mischten sie mit Nahrung (Olivenöl) und leuchteten sie mit einem speziellen UV-Licht an.
Das Ergebnis: Die meisten Pilze leuchteten nicht. Aber ein Pilz, den sie Y-A02 nannten, leuchtete hell mit einem orangefarbenen Hof. Dieses Leuchten bedeutete, dass er das Öl erfolgreich „zerschneidete“. Sie identifizierten diesen Pilz als eine Art Schwarzen Schimmel (Aspergillus niger).

Schritt 2: Den Arbeiter super-aufladen (Mutagenese)

Der ursprüngliche Pilz war gut, aber die Wissenschaftler wollten, dass er großartig wird. Sie nutzten eine Technik namens Mutagenese, was so etwas wie eine kontrollierte „Impfung“ durch Stress ist, um ihn zur Evolution zu zwingen.

Die Analogie: Betrachten Sie den Pilz als einen Schüler. Zuerst gaben sie dem Schüler ein wenig „Sonnenbrand“ (UV-Licht), um sein Gehirn zu wecken. Dann gaben sie ihm einen spezifischen chemischen „Test“ (Nitrosoguanidin), um ihn zu zwingen, härter zu lernen.
Das Ergebnis: Sie erschufen Tausende von mutierten Versionen des Pilzes. Sie suchten nach derjenigen, die am hellsten leuchtete. Sie fanden einen „Superstar“-Mutanten namens Y-B04. Diese neue Version produzierte 127 % mehr fettzerschneidende Scheren als das Original. Es war, als fände man einen Arbeiter, der die doppelte Arbeit in der gleichen Zeit erledigen kann.

Schritt 3: Das perfekte Umfeld schaffen (Fermentation)

Selbst ein Super-Arbeiter braucht das richtige Büro, um gut zu performen. Die Wissenschaftler passten die „Bürobedingungen“ (die Flüssigkeit, in der der Pilz wächst) an, um das Maximum an Scheren zu erhalten.

Die Analogie: Sie probierten verschiedene Temperaturen, pH-Werte (Säuregehalt) und Mengen an „Nahrung“ (Zucker und Protein) aus.
Der ideale Punkt: Sie fanden heraus, dass der Pilz bei 21 °C (einer kühlen Raumtemperatur), einem leicht sauren Milieu (pH 6,0) und einer spezifischen Menge an „Saat“ (Sporen), um die Party zu starten, am besten arbeitet.
Das Ergebnis: Unter diesen perfekten Bedingungen produzierte der Pilz eine gewaltige Menge Lipase: 57,26 Einheiten pro Milliliter.

Schritt 4: Das Produkt reinigen (Aufreinigung)

Die Flüssigkeit, die aus dem Fermentationsbehälter kam, war wie ein Smoothie voller Früchte, aber auch voller Kerne, Schalen und Fruchtfleisch. Sie brauchten nur die „Frucht“ (die reine Lipase).

Die Analogie: Sie verwendeten einen dreistufigen Reinigungsprozess:
1. Salzausfällung (Salting Out): Sie fügten der Mischung Salz hinzu. Dies bewirkte, dass das „schlechte Zeug“ verklumpte und absank, während die gute Lipase schwimmend zurückblieb.
2. Der Magnet (Chromatographie): Sie leiteten die Flüssigkeit durch eine spezielle Säule, die wie ein Magnet wirkte, die Lipase einfing und den Rest passieren ließ.
3. Das Sieb (Gelfiltration): Schließlich leiteten sie sie durch ein winziges Sieb, um Moleküle nach Größe zu trennen.
Das Ergebnis: Sie erhielten ein sehr reines, hochwertiges Produkt. Die „Scheren“ waren nun 14 Mal leistungsfähiger pro Gramm als zu Beginn.

Was macht diese Lipase so besonders?

Die Wissenschaftler testeten ihre neuen „Kälte-Arbeiter“-Scheren und fanden einige erstaunliche Eigenschaften:

Kälteanpassung: Während die meisten Scheren erhitzt werden müssen (auf 40 °C oder höher), um zu funktionieren, arbeiten diese am besten bei 30 °C und sind bei 15 °C immer noch sehr aktiv. Sie fühlen sich in der Kälte wohl.
Zerbrechlich, aber schnell: Da sie für die Kälte gebaut sind, sind sie etwas empfindlich. Wenn man sie zu stark erhitzt (über 40 °C), bauen sie schnell ab. Aber in der Kälte sind sie unglaublich effizient.
Lieblingsspeisen: Sie bevorzugen das Zerschneiden von „mittellangen“ Fettketten (wie C8 bis C12), die in vielen natürlichen Ölen vorkommen.
Metallreaktionen: Einige Metalle (wie Kalzium) ließen sie noch schneller arbeiten, während schwere Metalle (wie Kupfer oder Zink) wie Gift wirkten und sie stoppten.

Das Fazit

Die Arbeit behauptet, dass das Team durch das Finden eines Pilzes in einem gefrorenen Wald, das Geben eines genetischen „Schubs“ und die Fütterung mit der perfekten Diät ein hocheffizientes, kälteliebendes Enzym erschaffen hat.

Wofür laut Papier verwendet werden kann:
Die Autoren erwähnen spezifisch, dass dieses Enzym verwendet werden könnte für:

Lebensmittelverarbeitung: Handhabung hitzeempfindlicher Lebensmittel, ohne diese zu kochen.
Waschen bei niedrigen Temperaturen: Waschmittel, die in kaltem Wasser funktionieren (Energie sparen).
Umweltmanagement: Reinigung von Ölverschmutzungen oder Abfällen in kalten Umgebungen.

Die Studie liefert eine Blaupause dafür, wie man diese Enzyme in großen Mengen herstellt, und löst damit das Problem der hohen Kosten und der geringen Aktivität, die normalerweise mit Kälte-Enzymen einhergehen.

Technische Zusammenfassung: Züchtung von hochertragreichen Niedrigtemperatur-Lipase-Pilzen, Optimierung der Fermentationsbedingungen sowie Isolierung und Aufreinigung von Lipase

Problemstellung
Konventionelle Lipasen besitzen oft erhöhte optimale Katalysatortemperaturen, was bei der Verarbeitung hitzeempfindlicher Materialien zu Substratinaktivierung und Produktdegradation führen kann. Diese Einschränkung resultiert in einer reduzierten Biotransformationsleistung und beeinträchtigten Erträgen. Während Niedrigtemperatur-Lipasen (aktiv unter 40 °C, mit Optima zwischen 0–30 °C) eine Lösung für umweltfreundliche, energieeffiziente industrielle Prozesse bieten, leiden sie häufig unter geringer Aktivität, hohen Produktionskosten und begrenzter Verfügbarkeit. Diese Studie adressiert den Bedarf an einem effizienten, hochertragreichen Produktionssystem für Niedrigtemperatur-Lipasen zur Unterstützung von Anwendungen in der Lebensmittelverarbeitung, der Niedrigtemperaturwäsche und der Umweltverwaltung.

Methodik
Die Forschung folgte einem mehrstufigen Ansatz, der Stammscreening, Mutationszüchtung, Fermentationsoptimierung und Enzymaufreinigung umfasste:

Stammscreening: Bodenproben wurden aus den kalten Waldregionen des Daxing'anling-Gebiets in der Provinz Heilongjiang (Jahresmitteltemperatur -4 °C bis -2 °C) gesammelt. Das initiale Screening erfolgte mittels Rhodamin-B-Lipid-Screening-Medium zur Identifizierung fluoreszierender Halos, gefolgt von einem Re-Screening unter Verwendung der p-Nitrophenylbutyrat-Methode zur Quantifizierung der Lipaseaktivität.
Stammidentifizierung: Der ausgewählte Stamm, bezeichnet als Y-A02, wurde mittels PCR-Amplifikation der ITS-Region und phylogenetischer Analyse identifiziert, was ihn als Aspergillus niger bestätigte.
Mutationszüchtung: Um den Lipaseertrag zu steigern, wandte die Studie eine kombinierte Mutationsstrategie an, die Ultraviolettstrahlung (UV) und Nitrosoguanidin (NTG) kombinierte.
- UV-Behandlung: Sporensuspensionen wurden unterschiedlichen Dauern der 254-nm-UV-Bestrahlung ausgesetzt (0–160 s). Eine Letalitätsrate von ca. 82,9 % bei 120 s wurde als optimal ausgewählt.
- NTG-Behandlung: Sporen wurden unterschiedlichen NTG-Konzentrationen (0,05–0,30 %) ausgesetzt. Eine Konzentration von 0,15 %, die eine Letalitätsrate von 78,9 % ergab, wurde ausgewählt.
- Kombinationsmutation: Mutanten wurden einer 120-sekündigen UV-Exposition gefolgt von einer 0,15 %igen NTG-Behandlung unterzogen. Mutanten mit größeren fluoreszierenden Halos wurden zur weiteren Evaluierung ausgewählt.
Fermentationsoptimierung: Ein-Faktor-Experimente bestimmten die Auswirkungen von Temperatur, pH-Wert, Inokulumgröße, Stickstoffquellen und Kohlenstoffquellen. Anschließend wurde eine Box-Behnken-Response-Surface-Methodik (RSM) verwendet, um drei kritische Faktoren zu optimieren: Temperatur, pH-Wert und Inokulumgröße.
Aufreinigung: Die Lipase wurde aus dem Fermentationsüberstand des Mutantenstamms (Y-B04) durch ein sequenzielles Protokoll aufgereinigt: Ammoniumsulfat-Fraktionierung (30 % und 60 % Sättigung), Dialyse, Q-HP-Anionenaustauschchromatographie und Superdex 75 Gel-Filtrationschromatographie.
Charakterisierung: Die Eigenschaften des aufgereinigten Enzyms wurden evaluiert, einschließlich optimaler Reaktionstemperatur und des pH-Werts, thermischer und pH-Stabilität, der Einflüsse von Metallionen und organischen Lösungsmitteln, Substratspezifität sowie kinetischer Parameter ( $K_m$ und $V_m$ ).

Wesentliche Ergebnisse

Stammverbesserung: Der Mutantenstamm Aspergillus niger Y-B04, abgeleitet vom Elternstamm Y-A02 durch UV-NTG-Kombinationsmutation, zeigte eine Steigerung der Lipaseproduktion um 127,35 % im Vergleich zum ursprünglichen Stamm.
Genetische Stabilität: Der Stamm Y-B04 wies über fünf aufeinanderfolgende Generationen eine exzellente genetische Stabilität auf, wobei die Lipaseaktivität nur innerhalb eines engen Bereichs schwankte (48,45–50,21 U/mL).
Fermentationsoptimierung: Durch RSM wurden die optimalen Fermentationsbedingungen als 21 °C, pH 6,0 und eine Inokulumgröße von 6,5 × 10⁶ Sporen/mL ermittelt. Unter diesen Bedingungen erreichte die Lipaseproduktion 57,26 U/mL, was eng dem Modellwert von 58,06 U/mL entspricht (Abweichung von nur 1,4 %).
Aufreinigung und spezifische Aktivität: Der Aufreinigungsprozess führte zu einer 14,15-fachen Steigerung der spezifischen Aktivität auf 113,52 U/mg. Die fertige Präparation zeigte eine einzelne Bande von etwa 36 kDa im SDS-PAGE.
Enzymatische Eigenschaften:
- Temperatur: Die optimale Reaktionstemperatur liegt bei 30 °C. Das Enzym behält über 60 % seiner Aktivität bei 15 °C und über 80 % der Aktivität zwischen 20–40 °C bei. Es ist oberhalb von 30 °C thermisch instabil und behält nach 1 Stunde bei 50 °C weniger als 20 % seiner Aktivität.
- pH-Wert: Die optimale Aktivität tritt bei pH 7,0 auf, wobei eine relative Aktivität von über 80 % zwischen pH 6,0 und 7,0 aufrechterhalten wird.
- Stabilität: Das Enzym ist stabil bei 4 °C und 20 °C für 5 Stunden, verliert jedoch bei höheren Temperaturen schnell an Aktivität.
- Einfluss von Additiven: Ca²⁺, Na⁺ und K⁺ (bei 1 mM) aktivierten das Enzym, während Schwermetallionen (Fe³⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺) und Mg²⁺ die Aktivität signifikant inhibierten. Die meisten organischen Lösungsmittel inhibierten das Enzym, wobei 10 % Methanol die Aktivität um 18,41 % steigerte.
- Spezifität: Die Lipase zeigte die höchste Aktivität gegenüber mittelkettigen Substraten (C8-C12), wobei C8 (p-NPC8) eine relative Aktivität von 100 % aufwies.
- Kinetik: Das Enzym wies eine Michaelis-Konstante ( $K_m$ ) von 19,86 mmol/L und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit ( $V_m$ ) von 0,178 mmol/(L·min) auf.

Bedeutung und Ansprüche
Die Autoren behaupten, dass diese Studie eine wissenschaftliche Grundlage und praktikable Lösungen für die großtechnische Produktion von Niedrigtemperatur-Lipasen bietet. Durch die erfolgreiche Isolierung eines hochertragreichen Aspergillus niger-Stammes und die Optimierung seiner Produktion durch Mutationszüchtung und Fermentationskontrolle bietet die Forschung eine mikrobielle Quelle, die in der Lage ist, Enzyme effizient zu produzieren, die bei niedrigen Temperaturen effektiv funktionieren.

Die Studie hebt hervor, dass das resultierende Lipase den Energieverbrauch und die Betriebskosten in Branchen wie der Lebensmittelverarbeitung, der Niedrigtemperaturwäsche und der Sanierung der Umwelt senken kann. Im Vergleich zu kommerziellen Lipasen bietet das entwickelte Enzym eine kürzere Reaktionszeit, minimale Auswirkungen auf die Substratqualität und ein reduziertes Risiko thermischer Schäden an hitzeempfindlichen Produkten. Die Autoren positionieren diese Arbeit als einen Beitrag zum Ressourcenpool der Niedrigtemperatur-Lipase-produzierenden Bakterien und zeigen auf, dass Mutationszüchtung in Kombination mit verfeinerter Fermentations- und Aufreinigungskontrolle sowohl den Ertrag als auch die Leistung dieser Enzyme signifikant steigern kann.

Die Arbeit räumt Einschränkungen ein und stellt fest, dass der Stamm unter Laborbedingungen zwar stabil ist, die industrielle Skalierbarkeit jedoch weitere Bewertungen hinsichtlich Produktionskosten, Prozessmachbarkeit und langfristiger Stammerhaltung erfordert. Zukünftige Arbeiten sollen Multi-Omics-Technologien erforschen, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, und Protein-Engineering zur weiteren Leistungssteigerung durchführen.