First report of genetic transformation and CRISPR/Cas12a-mediated gene editing of European beech (Fagus sylvatica L.) employing a transient protoplast system

Resumen Técnico: Primer Informe de Transformación Genética y Edición Genómica Mediada por CRISPR/Cas12a en el Haya Europeo (Fagus sylvatica L.) Empleando un Sistema de Protoplastos Transitorios

Planteamiento del Problema
El haya europea (Fagus sylvatica L.) es una especie de madera dura dominante en Europa Central, crítica para los servicios ecosistémicos y la producción de madera. Sin embargo, su vitalidad se ve cada vez más amenazada por el cambio climático, lo que requiere una comprensión molecular urgente sobre la resiliencia al estrés. A pesar de la disponibilidad de un genoma de referencia de alta calidad, la genómica funcional en el haya se ha quedado significada atrás respecto a los cultivos anuales e incluso respecto a géneros de árboles modelos como Populus. Esta brecha se atribuye a los largos tiempos de generación (~50 años), genomas altamente heterocigotos y, lo que es más crítico, una profunda recalcitrancia a la regeneración in vitro. En consecuencia, los enfoques de transformación estable son incipientes, y no se ha reportado ningún protocolo de transformación de protoplastos o edición genómica en esta especie, lo que limita la capacidad de validar la función de los genes o de la ingeniería de rasgos.

Metodología
Los autores desarrollaron un sistema de protoplastos transitorios para sortear los cuellos de botella de la regeneración. El flujo de trabajo involucró tres componentes técnicos principales:

1. Aislamiento y Cultivo de Protoplastos: Los protoplastos se aislaron de hojas de plántulas mediante digestión enzimática (celulasa y macerozima) tras la esterilización superficial. El estudio optimizó el tiempo de aislamiento, identificando que las hojas recolectadas durante el periodo de invierno a finales de primavera (enero–mayo) y otoño (septiembre–noviembre) produjeron la mayor viabilidad y cantidad. La regeneración de la pared celular se confirmó mediante la tinción con Calcofluor White, y la proliferación se monitoreó durante 12 semanas.
2. Transformación Transitoria Mediada por PEG: Se llevó a cabo una optimización sistemática de la captación de ADN mediada por Polietilenglicol (PEG). Los parámetros clave probados incluyeron la densidad celular, la cantidad de ADN, el tiempo de preincubación en hielo, el tipo de PEG (PEG1500 vs. PEG4000), la concentración de PEG, la duración de la incubación y el uso de choque térmico. El buffer óptimo identificado fue MMG (que contiene 15 mM de CaCl₂) en lugar de W5.
3. Desarrollo de Herramientas Moleculares y Edición Genómica:
   • Ensayos de Promotores-Reporteros: Se probaron seis promotores constitutivos (CaMV35S, AtuNOS, AtuOCS, AtUBQ10, HaUBI, PcUBI) impulsando reporteros mEGFP o turboRFP para establecer un kit de herramientas moleculares.
   • Edición mediante CRISPR/Cas12a: Se seleccionó el gen PHYTOENE DESATURASE (FsPDS) utilizando una variante de LbCas12a tolerante a la temperatura (ttLbCas12a) y cuatro crRNAs distintos dirigidos a los exones 3 y 5. La eficiencia de edición se cuantificó mediante secuenciación de amplicones (Illumina) y se analizó con CRISPResso2 y CLC Genomics Workbench.

Resultados Clave

• Rendimiento y Viabilidad de los Protoplastos: El protocolo optimizado produjo un promedio de 5.5 × 10⁷ protoplastos g⁻¹ de peso fresco (FW), con rendimientos máximos alcanzando 1.5 × 10⁷ protoplastos g⁻¹ FW. La viabilidad media fue del 94.2%. La regeneración de la pared celular ocurrió dentro de las 24 horas y se formaron microcolonias a las 12 semanas, aunque el sistema no permitió la regeneración más allá de la etapa de microcallo bajo las condiciones actuales.
• Optimización de la Transformación: La optimización secuencial identificó una eficiencia de transformación máxima de 59 ± 6.19% (lograda en octubre) utilizando el conjunto de parámetros G: 5 × 10⁵ protoplastos en 250 µL de MMG, 25 µg de ADN plasmídico, 30 min de preincubación en hielo, 40% de PEG1500 y una incubación de 5 minutos.
  • Factores Críticos: Extender la preincubación del ADN a 30 min y utilizar PEG1500 (en lugar de PEG4000) mejoró significativamente la eficiencia. El choque térmico (42°C) resultó perjudicial.
  • Variabilidad Estacional: La eficiencia de la transformación mostró una variación temporal pronunciada a lo largo del año, observándose un descenso brusco en finales de otoño/invierno, lo que sugiere que un fuerte ritmo circanual endógeno influye en la competencia fisiológica, independientemente de las condiciones de crecimiento controladas.
• Validación de Promotores: Los seis promotores probados impulsaron una expresión detectable. El promotor PcUBI (que impulsa turboRFP) alcanzó la mayor eficiencia aparente (>20%), mientras que AtuNOS y AtuOCS produjeron los resultados más bajos.
• Edición Genómica: El sistema ttLbCas12a indujo con éxito deleciones dirigidas en FsPDS. Las eficiencias de edición (normalizadas a la eficiencia de transformación) oscilaron entre el 4.75% y el 32.69% dependiendo del crRNA. El sistema produjo exclusivamente deleciones (1–24 pb), siendo los tamaños más frecuentes de 5–10 pb. No se detectaron inserciones. Los patrones de deleción específicos fueron únicos para cada crRNA.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que este trabajo representa el primer informe tanto de la transformación genética transitoria como de la edición genómica mediada por CRISPR/Cas en el haya europeo.

• Base para la Genómica Funcional: Este estudio establece un "kit de herramientas moleculares básicas" (promotores, reporteros y un protocolo de transformación) que permite realizar ensayos funcionales rápidos e independientes de la regeneración. Esto permite la validación de genes candidatos y el cribado de constructos de edición sin necesidad de transformación estable.
• Prueba de Concepto para la Edición: La generación exitosa de deleciones en FsPDS demuestra que el sistema ttLbCas12a es funcional en las células del haya, superando la sensibilidad térmica asociada frecuentemente con la Cas12a estándar en el cultivo de tejidos vegetales.
• Limitaciones y Perspectivas Futuras: Los autores señalan modestamente que, si bien el sistema transitorio está establecido, la falta de un sistema de regeneración de plantas completas robusto restringe actualmente la generación de plantas editadas estables. Enfatizan que la variabilidad estacional observada en la eficiencia requiere mayor investigación y que el trabajo futuro debe centrarse en establecer genotipos competentes para la regeneración, con el fin de trasladar estos ensayos transitorios a las aplicaciones de fitomejoramiento. La plataforma se presenta como un paso intermedio valioso para el estudio de la resiliencia climática en esta especie de árbol no modelo.