Kilohertz electrical stimulation drives widespread neuronal activation and temporal interference imposes focal rhythmic modulation

Resumen Técnico: La estimulación eléctrica de kilohertz impulsa una activación neuronal generalizada y la interferencia temporal impone una modulación rítmica focal

Planteamiento del problema
La estimulación por interferencia temporal (TI, por sus siglas en inglés) ha surgido como una técnica no invasiva prometedora para dirigirse a estructuras cerebrales profundas. Su premisa teórica se basa en la interacción de dos campos eléctricos de alta frecuencia (kilohertz) con frecuencias ligeramente desplazadas, que generan una envolvente modulada en amplitud (AM) a la frecuencia de diferencia. La hipótesis predominante postula que las neuronas son insensibles a las señales portadoras de alta frecuencia debido a las propiedades de filtrado de paso bajo de la membrana neuronal, respondiendo solo a la envolvente AM de baja frecuencia. Por consiguiente, se espera que la TI active selectivamente los objetivos profundos donde la envolvente AM es más fuerte, preservando al mismo tiempo los tejidos superficiales expuestos únicamente a las portadoras no moduladas. Sin embargo, este supuesto no ha sido probado rigurosamente a nivel celular, particularmente en lo que respecta a si los campos de kilohertz no modulados son fisiológicamente inertes o si la distribución espacial de la activación neuronal coincide estrictamente con la envolvente AM predicha. Además, la dinámica espaciotemporal de las respuestas neuronales a la TI, incluyendo los efectos subumbrales y la sincronización rítmica a nivel de neurona individual, sigue sin explorarse ampliamente.

Metodología
Los autores emplearon un enfoque multimodal que combina el modelado computacional in silico, preparaciones de cortes cerebrales ex vivo e imágenes in vivo en ratones para caracterizar las respuestas neuronales a la TI y a la estimulación de alta frecuencia.

• Modelos experimentales: El estudio utilizó modelos de ratón que expresan indicadores de calcio genéticamente codificados (jGCaMP8s) e indicadores de voltaje (JEDI-2P) mediante inyecciones virales intracerebroventriculares.
• Paradigmas de estimulación:
  • TI premodulada (pmTI): Para aislar los efectos de la forma de onda, los autores aplicaron formas de onda presintetizadas con índices de AM definidos (0%, 50%, 100%) a cortes cerebrales, evitando la complejidad espacial de la interferencia de electrodos duales.
  • TI convencional: Dos pares de electrodos entregaron corrientes a 2000 Hz y 2001 Hz (frecuencia de batido de 1 Hz) para generar campos de interferencia tanto en cortes como in vivo.
  • Controles: Se utilizaron estimulaciones de alta frecuencia no moduladas (solo portadora) y controles simulados (sham) para la comparación.
• Imagen y registro:
  • Microscopía de dos fotones: Se utilizó para monitorear las respuestas neuronales individuales (transitorios de calcio y cambios de voltaje) con alta resolución espacial y temporal, evitando artefactos eléctricos.
  • Inmunohistoquímica: Se cuantificó la expresión de c-Fos tras una estimulación prolongada (20 minutos) para evaluar la activación neuronal generalizada en las regiones corticales y cerebrales profundas.
  • Modelado computacional: Las simulaciones en NEURON utilizando modelos biofísicos de neuronas piramidales corticales y compartimentos axonales se usaron para investigar los mecanismos iónicos y las distribuciones espaciales del campo.

Contribuciones clave y resultados

1. La estimulación de kilohertz no modulada es suficiente para impulsar la actividad neuronal:
   Contrario al supuesto de que las portadoras de kilohertz son ineficaces, el estudio demuestra que la estimulación de alta frecuencia no modulada (AM0) por sí sola es suficiente para evocar la activación y la despolarización subumbral. En cortes cerebrales, la corriente umbral requerida para provocar respuestas fue en realidad menor para las portadoras no moduladas que para las formas de onda moduladas en amplitud (AM50, AM100). Esto sugiere que el campo de alta frecuencia por sí mismo impulsa la activación, probablemente a través de un mecanismo donde la activación rápida de los canales de sodio supera la activación más lenta de los canales de potasio, lo que conduce a una despolarización de la membrana acumulativa.

2. La modulación de amplitud organiza la estructura temporal, no la focalidad espacial:
   Si bien la activación ocurrió ampliamente en todo el campo de estimulación, la estructura temporal de la respuesta fue distinta.

   • Activación generalizada: Tanto la estimulación de la portadora como la de TI reclutaron neuronas en todo el campo de imagen, sin diferencias significativas en la distribución espacial de las células respondientes.
   • Modulación rítmica focal: Solo la estimulación por TI (con AM) impuso una sincronización rítmica a la frecuencia de batido (por ejemplo, 1 Hz). Esta sincronización estaba espacialmente restringida, siendo más fuerte cerca del centro del campo de interferencia donde el índice de AM era mayor, y disminuyendo con la distancia. Por lo tanto, la TI no confina la activación a un punto focal, sino que impone una modulación temporal focal sobre una población activada ampliamente.

3. Despolarización rítmica subumbral:
   Utilizando indicadores de voltaje (JEDI-2P), los autores mostraron que incluso en intensidades subumbrales donde no se generan potenciales de acción, la estimulación por TI indujo oscilaciones rítmicas en el potencial de membrana sincronizadas con la frecuencia de batido. La estimulación de la portadora indujo despolarización pero careció de esta organización rítmica. Esto indica que la TI puede modular la excitabilidad y el tiempo neuronal sin necesariamente impulsar disparos suprumbrales.

4. Validación in vivo y expresión de c-Fos:

   • Imagen in vivo: En ratones anestesiados y despiertos, la estimulación por TI provocó transitorios de calcio rítmicos sincronizados con la frecuencia de batido, mientras que la estimulación de la portadora produjo actividad no rítmica de amplitud comparable.
   • Activación a largo plazo: La estimulación prolongada (20 minutos) resultó en una regulación positiva significativa de c-Fos en la corteza (cerca de los electrodos) tanto para las condiciones de TI como para las de la portadora. Sin embargo, no se observó un aumento significativo de c-Fos en el objetivo profundo (hipocampo), lo que sugiere que la magnitud del campo eléctrico local en el objetivo profundo fue insuficiente para impulsar la expresión de genes de respuesta temprana, a pesar de la presencia de AM. Esto refuerza que la activación es impulsada por la fuerza del campo, mientras que la AM dicta el cronometraje de dicha activación.

Significado y afirmaciones
El artículo afirma proporcionar un marco revisado para comprender la estimulación por TI. Los autores argumentan que la TI no debe verse primordialmente como un método para generar activación neuronal focal, sino como un método para imponer una modulación temporal focal sobre una activación neuronal generalizada.

• Perspectiva mecánica: El estudio desafía la noción de que las portadoras de kilohertz son fisiológicamente inertes. En su lugar, propone que el campo de alta frecuencia impulsa la despolarización mediante la cinética de los canales iónicos, mientras que la modulación de amplitud organiza la temporalidad de esta actividad.
• Implicaciones terapéuticas: Los hallazgos sugieren que la "focalidad" de la TI es temporal en lugar de espacial. Esto tiene implicaciones para la interpretación de datos clínicos (por ejemplo, respuestas BOLD de fMRI) y el diseño de protocolos de estimulación. Los autores sugieren que la activación generalizada podría ser terapéuticamente útil para modular la conectividad de la red, mientras que la AM focal puede utilizarse para entrenar selectivamente ritmos específicos en objetivos profundos.
• Direcciones futuras: Los autores destacan que el entrenamiento eficaz de la TI puede requerir amplitudes de estimulación más altas de lo que se asumía anteriormente, particularmente en frecuencias portadoras más altas, y que la interacción entre la modulación externa y los estados cerebrales endógenos es crítica para la eficacia.

El estudio concluye que la estimulación de frecuencia de kilohertz es en sí misma un régimen neuromodulador potente, y que la TI representa una aplicación específica donde la modulación de amplitud se utiliza para dar forma a la dinámica temporal de esta activación generalizada.