Towards Culture-Free Sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Evaluating New Targeted and Whole-Genome Approaches for Genotyping and Drug Resistance Profiling

Resumen Técnico: Hacia la secuenciación libre de cultivos de Mycobacterium tuberculosis

Planteamiento del problema
El manejo de la tuberculosis resistente a los fármacos (TB-DR) se ve actualmente obstaculizado por la falta de herramientas de diagnóstico rápido capaces de predecir de manera integral la resistencia a todo el espectro de fármacos incluidos, incluyendo agentes nuevos como la bedaquilina y el pretomanid. Aunque la secuenciación de genoma completo basada en cultivos (cWGS) sirve como estándar de referencia para el perfilado de resistencia y el análisis de transmisión, requiere semanas o incluso meses para el aislamiento bacteriano, lo que retrasa las decisiones de tratamiento y la vigilancia. Aunque la secuenciación de nueva generación dirigida (tNGS) ofrece una alternativa libre de cultivos, está limitada a regiones genómicas predefinidas, lo que puede omitir variantes novedosas y carecer de la resolución necesaria para un análisis de transmisión de alta resolución. Por el contrario, la secuenciación de genoma completo directa (dWGS) a partir de especímenes clínicos promete un análisis exhaustivo, pero históricamente ha sufrido de una baja sensibilidad debido al alto fondo de ADN del huésped y una profundidad de cobertura insuficiente. Existe una necesidad urgente de evaluar y comparar los nuevos flujos de trabajo de tNGS y dWGS libres de cultivos para determinar su viabilidad para aplicaciones clínicas y de salud pública.

Metodología
Este estudio llevó a cabo una evaluación comparativa de dos ensayos de secuenciación libres de cultivos en 96 muestras de esputo descontaminadas de un ensayo de vacuna en Sudáfrica y Tanzania, que abarcan un amplio rango de cargas bacilares (<10 a >1.000 copias de genoma/µL).

• Muestras: El ADN se extrajo utilizando un protocolo de deplesión de huéspedes (kit Ultra-Deep Microbiome Prep) y se cuantificó mediante qPCR específica para el complejo M. tuberculosis (MTBC) dirigida al locus senX3-regX3.
• Ensayos evaluados:
  1. tNGS: El Deeplex Myc-TB XL (Genoscreen), un ensayo de secuenciación de amplicones dirigidos en fase de prueba beta que cubre 29 genes diana, incluyendo regiones para bedaquilina, pretomanid y clofazimina.
  2. dWGS: El QIAseq xHYB MTB (Qiagen), un flujo de trabajo de secuenciación de genoma completo directo basado en el enriquecimiento que utiliza sondas de captura híbrida para dirigirse a todo el genoma del MTBC.
• Estándar de referencia: Los resultados se contrastaron con la cWGS basada en cultivos realizada en los aislados correspondientes, utilizando el catálogo de mutaciones más reciente de la OMS para la interpretación de la resistencia.
• Análisis: Las métricas de desempeño incluyeron el límite de detección (LoD), la precisión de la predicción de la resistencia a los fármacos (sensibilidad/especificidad), la concordancia de genotipificación (asignación de linaje) y la capacidad de agrupamiento de transmisión.

Contribuciones clave y resultados

• Sensibilidad analítica y límite de detección:
  • tNGS (Deeplex Myc-TB XL): Demostró una sensibilidad superior con un límite de detección (LoD) de aproximadamente 10 copias de genoma (gc). Generó perfiles de resistencia interpretables en el 96,6% de los especímenes.
  • dWGS (QIAseq xHYB): Requirió una mayor entrada de ADN, con un LoD de aproximadamente 100 gc. Produjo datos adecuados para el análisis de resistencia a fármacos en el 75% de las muestras.
• Perfilado de resistencia a fármacos:
  • tNGS: Logró una sensibilidad del 100% para todos los fármacos evaluados (incluyendo bedaquilina, pretomanid, linezolid y fluoroquinolonas). La especificidad fue del 100% para la mayoría de los fármacos, con desviaciones menores para etionamida (≥97%) e isoniazida (≥98%), donde la tNGS detectó variantes del promotor fabG1 no confirmadas por cWGS, lo que sugiere la posible detección de heterogeneidad dentro del huésped perdida durante el cultivo.
  • dWGS: Mostró una sensibilidad del 100% para la mayoría de los fármacos de primera y segunda línea. Sin embargo, omitió un caso de resistencia a fluoroquinolonas (debido a los umbrales de variantes de baja frecuencia) y clasificó erróneamente la resistencia para delamanid y clofazimina en un caso cada uno debido a las reglas de interpretación del software. La especificidad fue del 100%, excepto para la rifampicina (≥97%), donde se detectaron dos variantes rpoB falsos positivos, probablemente debido a la captura fuera de objetivo de ADN no perteneciente al MTBC.
• Genotipificación y análisis de transmisión:
  • Asignación de linaje: Ambos métodos mostraron una alta concordancia con la cWGS. La dWGS logró una concordancia del 100% a nivel de linaje, mientras que la tNGS mostró una concordancia del 94,2%, con discrepancias principalmente en la resolución de sublinajes.
  • Agrupamiento de transmisión: La dWGS permitió con éxito el análisis de transmisión en el 65% de las muestras, identificando correctamente un grupo de transmisión detectado por cWGS, demostrando su utilidad para la vigilancia epidemiológica sin cultivo.
• Eficiencia del flujo de trabajo: El flujo de trabajo de tNGS se completó en menos de tres días, mientras que el flujo de trabajo de dWGS, que requiere cuantificación por qPCR y captura híbrida, tomó aproximadamente cinco días para 96 muestras.

Significancia y afirmaciones
El artículo afirma proporcionar la primera evaluación comparativa de un ensayo tNGS expandido y un flujo de trabajo dWGS basado en enriquecimiento sobre los mismos especímenes clínicos. Los autores concluyen que:

1. La tNGS ofrece una herramienta altamente sensible y específica para el perfilado de resistencia a fármacos libre de cultivos y rápido, con un límite de detección comparable al de los ensayos moleculares rápidos más sensibles.
2. La dWGS, aunque requiere mayores cargas bacterianas, permite un análisis de genoma completo robusto y libre de cultivos, incluyendo la inferencia de transmisión y la exploración de loci de resistencia candidatos más allá de los objetivos predefinidos.
3. Se propone una estrategia guiada por la carga bacilar: las muestras con cargas muy bajas (<10–50 gc) pueden requerir cultivo o tNGS, mientras que las muestras con cargas más altas (≥1.000 gc) son adecuadas para cualquiera de los dos enfoques, dependiendo de la necesidad de un perfilado rápido de resistencia (tNGS) frente a un análisis de transmisión de alta resolución (dWGS).

El estudio posiciona estos enfoques libres de cultivos como herramientas transformadoras para mejorar el manejo clínico de la TB-DR, fortalecer la vigilancia genómica y facilitar la evaluación de nuevos fármacos y vacunas en ensayos clínicos, siempre que los canales bioinformáticos y las reglas de interpretación se estandaricen y perfeccionen.