Engineered Nanobodies Against Aflatoxin B₁ and M₁: Expression, Optimization, and Robust Immunoassay Performance

Resumen Técnico: Nanocuerpos Diseñados Contra la Aflatoxina B₁ y M₁

Planteamiento del Problema
La aflatoxina B₁ (AFB₁) y su metabolito aflatoxina M₁ (AFM₁) son potentes carcinógenos del Grupo 1 que representan riesgos graves para la seguridad alimentaria, particularmente en cereales y productos lácteos. Aunque la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) ofrecen una alta precisión, su dependencia de equipos costosos y una preparación de muestras compleja limita su utilidad para el cribado rápido en el lugar de uso. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) son una alternativa preferida debido a su eficiencia y rentabilidad; sin embargo, su rendimiento se ve a menudo limitado por las restricciones de los anticuerpos policlonales y monoclonales tradicionales, que incluyen altos costos de producción, estabilidad limitada y dificultades en la producción masiva. Aunque los nanocuerpos (anticuerpos de dominio único) ofrecen ventajas teóricas, como una mayor estabilidad y facilidad de expresión procariota, las investigaciones previas se han centrado principalmente en la identificación de secuencias en lugar de una caracterización exhaustiva de la eficiencia de expresión, la optimización de la purificación y la robustez ambiental bajo condiciones de ensayo prácticas.

Metodología
Este estudio desarrolló un sistema de expresión procariota robusto para dos nanocuerpos diseñados, AFB₁-Nb y AFM₁-Nb, dirigidos a sus respectivos micotoxinas.

• Expresión y Purificación: Los genes de los nanocuerpos se clonaron en vectores pET-22b y se expresaron en Escherichia coli BL1(DE3). Las proteínas fueron inducidas con IPTG a 18 °C, aisladas del espacio periplasmático mediante choque osmótico y purificadas utilizando cromatografía de afinidad Ni-NTA. La pureza y el peso molecular (~17 kDa) se confirmaron mediante SDS-PAGE.
• Optimización del Ensayo: Se estableció un ELISA competitivo indirecto (icELISA) utilizando un método de titulación de tablero de ajedrez para optimizar las concentraciones de recubrimiento de antígenos y las relaciones de dilución de los nanocuerpos.
• Evaluación del Rendimiento: La sensibilidad (IC₅₀) y la especificidad (reactividad cruzada contra OTA y DON) de los nanocuerpos se determinaron mediante análisis de regresión no lineal.
• Robustez Ambiental: Se llevó a cabo una evaluación sistemática para evaluar la actividad de unión de los nanocuerpos bajo diversas condiciones de estrés, incluyendo exposición térmica (hasta 95 °C y 90 °C durante 75 minutos), niveles de pH (5.0–10.0), fuerza iónica (5–100 mM NaCl) y exposición a solventes orgánicos (metanol, DMF, DMSO, acetona y acetonitrilo al 10–80% v/v).

Resultados Clave

• Expresión: Ambos nanocuerpos se expresaron con éxito como proteínas solubles en E. coli con alta pureza, confirmada por la presencia de bandas distintas a aproximadamente 17 kDa.
• Sensibilidad: El icELISA optimizado demostró una alta sensibilidad, con concentraciones inhibitorias semimáximas (IC₅₀) de 1.126 ng/mL para AFB₁-Nb y 1.320 ng/mL para AFM₁-Nb.
• Especificidad: Ambos nanocuerpos exhibieron una excelente especificidad. El AFB₁-Nb mostró una reactividad cruzada mínima con AFM₁ (IC₅₀ 17.45 ng/mL), OTA y DON. Del mismo modo, el AFM₁-Nb mostró una baja reactividad cruzada con AFB₁ (IC₅₀ 14.45 ng/mL) y otras micotoxinas.
• Estabilidad Térmica: Se observó una diferencia distintiva en la tolerancia térmica. El AFM₁-Nb retuvo más del 90% de su actividad de unión tras la incubación a 90 °C durante 75 minutos, superando significativamente a los anticuerpos tradicionales y a muchos informes previos de nanocuerpos. En contraste, el AFB₁-Nb retuvo solo ~50% de actividad bajo las mismas condiciones, aunque su actividad aumentó con la temperatura hasta los 95 °C, potencialmente debido a la conversión de homodímeros débilmente asociados en monómeros activos.
• pH y Fuerza Iónica: Los nanocuerpos mostraron condiciones óptimas distintas. El AFB₁-Nb funcionó mejor a un pH neutro (7.4) y una fuerza iónica moderada (25 mM). El AFM₁-Nb mostró su actividad máxima en condiciones débilmente alcalinas (pH 9) y baja fuerza iónica (5–10 mM).
• Tolerancia a Solventes Orgánicos: Ambos nanocuerpos demostraron una alta tolerancia al metanol y la acetona. Notablemente, el AFM₁-Nb mantuvo una estabilidad constante en todos los solventes probados. El AFB₁-Nb mostró una recuperación única de actividad en concentraciones altas de metanol y acetona (>40%), lo que sugiere que los niveles altos de solvente pueden reducir la unión inespecífica o contrarrestar la desnaturalización parcial.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona una base experimental exhaustiva para la traslación de secuencias de nanocuerpos en herramientas de detección funcionales. La contribución primaria es el establecimiento de un protocolo de expresión y purificación procariota estandarizado y rentable que produce nanocuerpos de alta afinidad con estabilidad ambiental caracterizada.

El estudio destaca la naturaleza complementaria de los dos nanocuerpos:

1. El AFM₁-Nb se presenta como un componente altamente confiable para el desarrollo de herramientas de diagnóstico rápidas y en el lugar, específicamente debido a su excepcional resistencia a los procesos de pasteurización de alta temperatura y a los solventes orgánicos utilizados en la extracción.
2. El AFB₁-Nb se señala por su idoneidad para el análisis de granos de cereales, donde puede resistir las altas concentraciones de metanol típicamente requeridas para la extracción de muestras.

Los autores concluyen que estos nanocuerpos ofrecen un potencial significativo para mejorar el monitoreo de la seguridad alimentaria al proporcionar alternativas sensibles, estables y específicas a los anticuerpos tradicionales. Sin embargo, el artículo reconoce modestamente las limitaciones, señalando que la validación en matrices alimentarias reales (pruebas de recuperación de adición) y la ingeniería de proteínas adicional para mejorar la estabilidad térmica del AFB₁-Nb son pasos futuros necesarios antes de su despliegue industrial completo.