The effect of freeze-drying and storage on lactobacilli strains isolated from the gastrointestinal tract of wild boars using different cryoprotectants

Resumen Técnico: El efecto de la liofilización y el almacenamiento en cepas de Lactobacilli aisladas de jabalíes

Planteamiento del problema
Los probióticos desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de la salud gastrointestinal en los lechones, particularmente en la prevención de la diarrea post-destete. Sin embargo, las bacterias ácido lácticas (BAL) aisladas del tracto gastrointestinal de jabalíes ofrecen ventajas distintivas —como menores factores de virulencia y genes de resistencia a los antibióticos en comparación con las cepas de cerdos domésticos—, pero su viabilidad durante el procesamiento tecnológico sigue siendo un cuello de botella significativo. La liofilización es el método estándar para la producción de polvos probióticos estables; no obstante, el proceso somete a las células a estrés osmótico, formación de cristales de hielo y daño en la membrana. Existe una falta de datos específicos sobre la tolerancia a la liofilización y la estabilidad de almacenamiento a largo plazo de las cepas de Limosilactobacillus mucosae, Ligilactobacillus salivarius y Lactobacillus amylovorus derivadas de jabalíes. Este estudio aborda la necesidad de identificar crioprotectores óptimos para asegurar que estas cepas sobrevivan al procesamiento y mantengan una viabilidad suficiente (≥10⁶–10⁸ UFC/g) para su aplicación práctica en la cría de animales.

Metodología
El estudio evaluó tres cepas derivadas de jabalíes: L. mucosae M65A, L. salivarius M494A y L. amylovorus M624A.

• Aislamiento e Identificación: Las cepas fueron aisladas del intestino delgado y el colon de jabalíes en la República Checa e identificadas mediante la secuenciación del gen 16S rRNA.
• Formulaciones de Crioprotectores: Se evaluaron seis medios crioprotectores, categorizados en dos grupos:
  • Basados en leche: Leche descremada (SM), SM + trehalosa al 5% (SM+T), SM + sacarosa al 5% (SM+S) y SM + glutamato de sodio al 5% (SM+GL).
  • Basados en sacáridos: Trehalosa al 5% (T) y sacarosa al 5% (S).
• Procesamiento: Los pellets bacterianos fueron resuspendidos en los medios, alícuotados y liofilizados utilizando una temperatura de condensador de −55 °C.
• Almacenamiento y Análisis: La viabilidad se midió inmediatamente después de la liofilización (AFD) y tras el almacenamiento a 4–6 °C durante 30, 60, 90 y 120 días. Las tasas de supervivencia se calcularon basándose en las unidades formadoras de colonias (UFC/ml) antes y después del procesamiento. El análisis estadístico utilizó PERMANOVA de dos vías y pruebas post-hoc de Dunnett para comparar la eficacia de los medios y la estabilidad del almacenamiento.

Resultados Clave

• Supervivencia a la Liofilización: La viabilidad fue significativamente mayor (p < 0.01) en los medios basados en leche en comparación con los medios de solo sacáridos. No se observaron diferencias significativas entre los tres aislados bacterianos (p > 0.05).
  • El medio SM+S (leche descremada + sacarosa) demostró el efecto crioprotector más fuerte durante el proceso de liofilización, limitando la pérdida de viabilidad a aproximadamente el 47% (una reducción de 0.3 log).
  • En contraste, los medios de solo sacáridos (T y S) resultaron en pérdidas de viabilidad de hasta 1.78 unidades log.
• Estabilidad de Almacenamiento a Largo Plazo:
  • Medios Basados en Leche: Las cepas preservadas en medios basados en leche generalmente mantuvieron una alta viabilidad (10⁸–10⁹ UFC/ml) durante el período de 120 días.
    • El SM+GL (leche descremada + glutamato de sodio) fue el más efectivo para L. salivarius M494A y L. mucosae M65A, mostrando una pérdida de viabilidad insignificante durante los 120 días.
    • El SM (leche descremada sola) proporcionó la mejor estabilidad para L. amylovorus M624A, manteniendo la viabilidad hasta los 90 días.
  • Medios Basados en Sacáridos: Estos medios no lograron proporcionar protección a largo plazo. La viabilidad en los medios T y S cayó significativamente hacia el día 30, con recuentos finales de 10⁵–10⁷ UFC/ml después de 120 días.
• Variaciones Específicas de la Cepa: Aunque todas las cepas sobrevivieron bien en las formulaciones basadas en leche, el medio óptimo varió ligeramente según la cepa, lo que destaca las características fisiológicas únicas de estos aislados muestreados en la naturaleza.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la resistencia tecnológica de las cepas de L. salivarius, L. amylovorus y L. mucosae de jabalíes, especies para las cuales los datos de tolerancia a la liofilización son actualmente limitados. La contribución principal es la demostración de que los crioprotectores de un solo componente de sacáridos son insuficientes para preservar estos aislados específicos, mientras que las combinaciones de leche descremada con protectores de bajo peso molecular (sacarosa o glutamato de sodio) son altamente efectivas.

El estudio concluye que los crioprotectores basados en leche son esenciales para desarrollar formulaciones probióticas estables a partir de aislados de jabalí. Específicamente, el uso de leche descremada suplementada con glutamato de sodio permite la preservación de L. salivarius y L. mucosae con una pérdida insignificante durante cuatro meses, mientras que la leche descremada sola soporta a L. amylovorus durante tres meses. Los autores sostienen que estas cepas, cuando se procesan con los medios óptimos identificados, cumplen con los requisitos de viabilidad para aplicaciones probióticas comerciales en la cría de cerdos, ofreciendo una alternativa viable a las cepas derivadas de cerdos domésticos con riesgos de resistencia potencialmente menores.