Hypoxia-Induced HIF-1α Drives the Progression of Odontogenic Keratocysts via the Sonic Hedgehog Pathway and PLK1-Mediated Osteolytic Remodeling

Resumen Técnico: La inducción de HIF-1α por hipoxia impulsa la progresión de los quistes odontogénicos mediante la vía Sonic Hedgehog y la remodelación osteolítica mediada por PLK1

Planteamiento del Problema
Los quistes odontogénicos queratocísticos (QOK) son lesiones mandibulares agresivas caracterizadas por altas tasas de recurrencia y un crecimiento localmente destructivo. Si bien las mutaciones en la vía de señalización Sonic Hedgehog (específicamente PTCH1) son factores impulsores establecidos en un subconjunto de casos, los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la enfermedad en casos sin mutaciones siguen sin estar claros. Además, la agresiva resorción ósea asociada con los QOK no se explica completamente solo mediante factores epiteliales. Investigaciones previas han destacado el papel de los fibroblastos derivados de la pared del quiste dentro del microambiente tumoral (MET), pero se requiere elucidar la influencia específica del MET hipóxico en estos fibroblastos y su subsiguiente regulación de la remodelación ósea. Este estudio investiga si la hipoxia inducida por el Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α) impulsa la progresión del QOK a través de la vía SHH y cómo los fibroblastos hipóxicos median la remodelación osteolítica.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multimodal que combina el análisis de muestras clínicas, bioinformática y ensayos funcionales in vitro:

• Muestras Clínicas y Bioinformática: Se analizaron datos transcriptómicos de la base de datos GEO (GSE38494 y GSE176351) para identificar genes diferencialmente expresados (DEG), vías enriquecidas (GO, GSEA, ssGSEA) y patrones de expresión específicos de tipos celulares en tejidos de QOK frente a mucosa oral normal. Se realizó inmunohistoquímica (IHC) en 30 casos esporádicos de QOK y 8 controles de quistes dentígeros para validar la expresión proteica de HIF-1α, GLI1, Ki-67 y MMP-9.
• Modelos Celulares: Se aislaron fibroblastos primarios de tejidos de QOK y de mucosa oral normal. Se estableció un modelo de cultivo hipóxico (1% O₂) para simular el microambiente del quiste.
• Intervenciones Farmacológicas: Se utilizaron inhibidores específicos para diseccionar las vías de señalización:
  • KC7F2: Para inhibir la síntía de HIF-1α en los fibroblastos del QOK.
  • GANT-61: Para inhibir GLI1 (el efector aguas abajo de SHH) en los fibroblastos del QOK.
  • nMS-1286937: Para inhibir PLK1 en los precursores de osteoclastos.
• Ensayos Funcionales:
  • Fenotipo de Fibroblastos: Se realizaron ensayos de proliferación (CCK8, EdU) e invasión (Transwell) bajo condiciones de normoxia e hipoxia, con y sin inhibidores. La secreción de SHH se cuantificó mediante ELISA.
  • Remodelación Ósea: Se cultivaron células madre mesenquimales de médula ósea de rata (rBMSC) y macrófagos derivados de médula ósea de ratón (mBMM) en medio condicionado (CM) derivado de fibroblastos de QOK en normoxia o hipoxia. La diferenciación osteogénica se evaluó mediante tinción/actividad de ALP y qPCR (Runx2, Bmp2). La diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea se evaluaron mediante tinción de TRAP, ensayos de pozos de resorción ósea y Western blot (CTSK, MMP9).
  • Validación Mecanística: Se realizó RNA-seq de mBMM tratados con CM de QOK hipóxico para identificar los genes diana aguas abajo, seguido de validación mediante qPCR y Western blot de PLK1 y marcadores del ciclo celular.

Contribuciones Clave y Resultados

1. Hipoxia y Upregulación de HIF-1α en QOK: La bioinformática y la IHC confirmaron que los tejidos de QOK exhiben un microambiente hipóxico con una regulación al alza significativa de HIF-1α tanto en los compartimentos epiteliales como estromales en comparación con los controles. La expresión de HIF-1α se correlacionó positivamente con la activación de la vía SHH (GLI1), la proliferación (Ki-67) y la invasión (MMP-9).
2. El Eje HIF-1α/SHH Impulsa la Malignidad de los Fibroblastos: Los experimentos in vitro demostraron que la hipoxia aumenta la regulación al alza de HIF-1α en los fibroblastos del QOK, lo que a su vez activa la vía de señalización SHH (aumento de la secreción de SHH y la expresión de GLI1). Esta activación impulsa la proliferación e invasión de los fibroblastos. Crucialmente, la inhibición de HIF-1α (KC7F2) o de GLI1 (GANT-61) revirtió estos fenotipos malignos, confirmando que la hipoxia actúa aguas arriba de la vía SHH en los fibroblastos del QOK.
3. Los Fibroblastos Hipóxicos Modulan la Remodelación Ósea: El medio condicionado de los fibroblastos de QOK hipóxicos (HYPO-OKC-CM) ejerció un efecto dual sobre las células óseas:
   • Supresión de la Osteogénesis: Inhibió la diferenciación osteogénica de las rBMSCs (reducción de la actividad de ALP y de la expresión de Runx2/Bmp2).
   • Potenciación de la Osteoclastogénesis: Promovió significativamente la diferenciación y la actividad de resorción ósea de los mBMMs (aumento de células multinucleadas positivas para TRAP y pozos de resorción).
4. PLK1 como Mediador de la Osteólisis: La secuenciación del transcriptoma de los mBMM tratados con HYPO-OKC-CM reveló que la vía SHH no se activó directamente en estas células. En su lugar, PLK1 (quinasa tipo Polo 1) fue el gen más significativamente regulado al alza, junto con otros marcadores relacionados con la mitosis. El GSEA confirmó el enriquecimiento de las vías de "mitosis" y "ciclo celular".
5. La Inhibición de PLK1 Revierte la Osteólisis: El tratamiento de los mBMM con el inhibidor de PLK1 nMS-1286937 revirtió significativamente los efectos pro-osteoclásticos del CM de QOK hipóxico, reduciendo la formación de células positivas para TRAP y la expresión de marcadores de osteoclastos (CTSK, MMP9).

Significancia y Afirmaciones
Los autores concluyen que la progresión de los quistes odontogénicos queratocísticos es impulsada por un mecanismo dual que involucra a los fibroblastos del estroma del quiste:

1. Proliferación/Invasión de Fibroblastos: La hipoxia induce HIF-1α, lo que activa la vía de señalización SHH dentro de los propios fibroblastos, promoviendo su crecimiento agresivo e invasión.
2. Resorción Ósea: Los fibroblastos hipóxicos secretan factores que aumentan la regulación de PLK1 en los precursores de osteoclastos, impulsando la diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea, mientras que simultáneamente suprimen la osteogénesis.

El estudio identifica el eje HIF-1α-SHH y PLK1 como nuevos objetivos terapéuticos. Dirigirse a estas vías puede ofrecer estrategias para reducir la recurrencia y prevenir la severa destrucción ósea asociada con los QOK, particularmente en casos donde las mutaciones de la vía SHH están ausentes. Los autores reconocen limitaciones, señalando que el vínculo transcripcional directo entre HIF-1α y SHH, así como las moléculas específicas secretadas que median la regulación al alza de PLK1, requieren mayor investigación.