Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Cette étude caractérise les propriétés d'excitation à deux photons du fluorophore ATTO 490LS et démontre son efficacité pour l'imagerie multicolore duplexée avec un seul laser, en le combinant avec Alexa Fluor 488 pour l'observation de cerveaux de Drosophila.

L'essentiel

🌟 L'histoire : Une seule clé pour ouvrir deux portes

Imaginez que vous êtes un photographe qui veut capturer la vie à l'intérieur d'un cerveau de mouche (la drosophile), un petit laboratoire vivant très complexe. Pour voir les détails, vous avez besoin d'une lampe très puissante, un laser, qui agit comme un flash ultra-rapide.

Le problème ? La plupart des microscopes de laboratoire n'ont qu'une seule lampe (une seule couleur de laser). C'est comme si vous aviez une seule clé pour ouvrir toutes les portes de la maison.

Habituellement, si vous voulez voir deux choses différentes en même temps (par exemple, un neurone qui s'active en vert et une structure fixe en rouge), vous avez besoin de deux lampes différentes. Si vous n'avez qu'une seule lampe, les couleurs se mélangent et tout devient une boue indistincte.

🎨 La solution : Le caméléon "ATTO 490LS"

Les chercheurs de cette étude ont découvert un super-pouvoir chez un colorant spécial appelé ATTO 490LS.

Voici l'analogie pour comprendre ce qu'il fait :
Imaginez que ce colorant est un magicien.

1. Vous lui donnez un rayon de lumière "bleu-vert" (le laser à 920 nm).
2. Au lieu de renvoyer la même couleur, il l'absorbe et la transforme complètement en une lumière rouge vif.

C'est ce qu'on appelle un "décalage de Stokes long". En termes simples : l'entrée et la sortie sont à des couleurs très éloignées l'une de l'autre.

🧪 L'expérience : Deux couleurs avec une seule lampe

Grâce à ce magicien, les chercheurs ont pu faire quelque chose d'impressionnant :

• Ils ont utilisé une seule lampe (le laser à 920 nm).
• Cette lampe a illuminé deux choses en même temps :
  1. Un marqueur vert (Alexa Fluor 488) qui brille naturellement en vert.
  2. Le magicien rouge (ATTO 490LS) qui prend la lumière du laser et la renvoie en rouge.

Comme le rouge et le vert sont très différents, le microscope peut les séparer facilement, comme si vous portiez des lunettes 3D qui filtrent les couleurs. Résultat : ils ont pu voir les deux structures distinctement, sans avoir besoin d'acheter un deuxième laser coûteux.

🧠 Pourquoi c'est génial pour la science ?

Pensez au cerveau comme à une ville très animée la nuit.

• Le marqueur vert (comme GCaMP) est comme un feu de signalisation : il s'allume quand un neurone "parle" (activité électrique).
• Le marqueur rouge (ATTO 490LS) est comme un panneau de signalisation fixe : il montre où sont les routes et les bâtiments (la structure du cerveau).

Avant cette découverte, pour voir les feux et les panneaux en même temps avec un seul projecteur, c'était impossible. Maintenant, grâce à ce colorant "magique", les scientifiques peuvent :

1. Observer ce que le cerveau fait (les feux verts).
2. Observer où il le fait (les panneaux rouges).
3. Le tout avec un équipement simple et moins cher (une seule lampe).

🚀 En résumé

Cette étude nous dit : "Vous n'avez pas besoin d'un microscope de 1 million de dollars avec plein de lasers pour faire de l'imagerie complexe."

En utilisant ce colorant spécial ATTO 490LS, n'importe quel laboratoire avec un microscope standard peut maintenant voir deux mondes différents (le vert et le rouge) en même temps. C'est comme si on avait trouvé une nouvelle clé qui ouvre deux portes à la fois, permettant aux scientifiques de mieux comprendre comment notre cerveau fonctionne, un peu à la fois !

Résumé technique

Titre de l'étude

Caractérisation du colorant à grand décalage de Stokes (LSS) ATTO 490LS pour l'imagerie multiphotonique multicolore à laser unique.

1. Problématique

L'imagerie multiphotonique (2P) in vivo, en particulier chez Drosophila melanogaster, repose souvent sur des systèmes équipés d'un seul laser fixe (généralement à 920 nm) pour exciter les indicateurs génétiquement codés verts (comme GCaMP). Cependant, l'imagerie multicolore simultanée est limitée sur ces systèmes car la plupart des fluorophores rouges nécessitent des longueurs d'onde d'excitation différentes ou des lasers supplémentaires.
Les fluorophores à grand décalage de Stokes (Long-Stokes-Shift ou LSS) offrent une solution théorique : ils sont excités par une longueur d'onde courte mais émettent à une longueur d'onde beaucoup plus longue, réduisant ainsi le chevauchement spectrale et permettant une détection distincte même avec une excitation commune. Bien que le colorant ATTO 490LS ait un décalage de Stokes de 165 nm en excitation monocphotonique (excitation à 496 nm, émission à 661 nm), ses propriétés d'excitation à deux photons n'avaient jamais été caractérisées, limitant son utilisation dans les microscopes 2P standards.

2. Méthodologie

Les auteurs ont employé une approche combinant analyse spectrale et imagerie biologique sur des cerveaux de mouches ex vivo.

• Préparation des échantillons :
  • Utilisation de mouches transgéniques elav-Gal4 > UAS-TID-Dlg1. Le système TurboID (TID) couplé à la protéine d'échafaudage synaptique Dlg1 permet le marquage par proximité (BioID) des protéines biotinylées.
  • Les cerveaux ont été fixés et marqués avec un conjugué streptavidine-ATTO 490LS (se liant à la biotine) et un anticorps anti-c-Myc couplé à Alexa Fluor 488 (marquant la protéine de fusion TID-Dlg1 elle-même).
• Analyse Spectrale (Microscope Leica TCS SP8 DIVE) :
  • Balayage d'excitation : Mesure de l'intensité d'émission en faisant varier la longueur d'onde d'excitation de 680 nm à 1200 nm.
  • Balayage d'émission : Mesure du spectre d'émission pour des excitations fixes à 780 nm, 920 nm, 940 nm et 1040 nm.
• Imagerie Multiphotonique (Microscopes Thorlabs) :
  • Utilisation de deux microscopes différents (modèles "A-SCOPE" et "B-SCOPE") équipés d'un laser fibré fixe à 920 nm.
  • Détection simultanée sur deux photomultiplicateurs (PMT) : un filtre vert (500–550 nm) pour Alexa Fluor 488 et un filtre rouge (570–640 nm ou 605/70 nm) pour ATTO 490LS.
  • Comparaison des signaux pour évaluer la séparation spectrale et la capacité d'imagerie duplex.

3. Contributions Clés et Résultats

A. Caractérisation des propriétés optiques à deux photons

• Excitation optimale : L'analyse spectrale a révélé trois pics d'excitation à deux photons pour ATTO 490LS : 780 nm (pic global), 940 nm et 1040 nm.
• Compatibilité 920 nm : Bien que 780 nm soit le pic maximal, le pic à 940 nm est très proche de la longueur d'onde standard de 920 nm des lasers fibrés commerciaux. L'excitation à 920 nm produit un signal significatif, bien que inférieur au pic à 780 nm, mais suffisant pour l'imagerie.
• Émission : À toutes les longueurs d'onde d'excitation testées (y compris 920 nm), le pic d'émission se situe à 640 nm, confirmant un grand décalage de Stokes même en mode biphotonique.
• Réduction du bruit de fond : L'excitation à 920 nm génère moins d'autofluorescence que l'excitation à 780 nm, ce qui rend le 920 nm plus attrayant pour l'imagerie biologique profonde.

B. Imagerie Duplexe à Laser Unique

• Séparation des signaux : Les auteurs ont démontré avec succès l'imagerie simultanée d'ATTO 490LS (rouge) et d'Alexa Fluor 488 (vert) en utilisant un seul laser à 920 nm.
• Spécificité structurale : L'imagerie a permis de distinguer clairement des structures cérébrales spécifiques :
  • Le corps elliptique (ellipsoid body) marqué uniquement par ATTO 490LS.
  • Les lobes γ des corps en champignon (mushroom bodies) marqués uniquement par Alexa Fluor 488.
  • Les lobes α/β et les lobes antennaires marqués par les deux colorants.
• Efficacité : Malgré une intensité d'émission plus faible à 920 nm par rapport à 780 nm, le rapport signal/bruit reste excellent grâce à la séparation spectrale efficace et à l'utilisation de PMT à gain ajusté (1 % pour le rouge, 5 % pour le vert).

4. Signification et Impact

• Accessibilité technique : Cette étude valide l'utilisation de l'ATTO 490LS sur des microscopes multiphotoniques "legacy" ou standards équipés d'un seul laser à 920 nm. Cela élimine le besoin d'ajouter des lasers complexes ou coûteux pour l'imagerie multicolore.
• Outil pour la neurobiologie : Le colorant permet d'associer un marqueur structurel rouge stable (ATTO 490LS) à des indicateurs fonctionnels verts (comme GCaMP) pour l'imagerie de la dynamique calcique chez les animaux vivants.
• Perspectives futures : Les auteurs prévoient de développer des conjugués ATTO 490LS pour des systèmes de marquage chimique (HaloTag, SNAP-tag), permettant un marquage génétique spécifique in vivo. Cela ouvrira la voie à l'imagerie simultanée de l'activité neuronale et de la morphologie structurale dans des circuits neuronaux complexes chez Drosophila et d'autres modèles.

En résumé, ce travail transforme l'ATTO 490LS d'un simple colorant monocphotonique en un outil puissant pour l'imagerie multiphotonique multicolore, démocratisant l'accès à l'imagerie duplexe de haute qualité pour les laboratoires disposant d'équipements standards.