Optimisation of single-nuclei isolation and RNA sequencing of parasitic nematodes
यह अध्ययन परजीवी नेमेटोड्स के लिए एक अनुकूलित सिंगल-न्यूक्लिआई आइसोलेशन प्रोटोकॉल (SNIP) प्रस्तुत करता है जो मौजूदा विधियों की तुलना में यील्ड और आरएनए गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार करता है, जिससे स्वास्थ्य और रोग में गैर-मॉडल प्रजातियों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए विविध जीवन चरणों और लिंगों में उच्च-रिज़ॉल्यूशन ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा उत्पन्न करना सक्षम होता है।
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किसी जीवित चीज़ कैसे काम करती है, इसे समझने के लिए वैज्ञानिक अक्सर इसके सबसे छोटे निर्माण खंडों: कोशिकाओं (cells) को देखते हैं। मनुष्यों और परिचित प्रयोगशाला जानवरों में, शोधकर्ता व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर आनुवंशिक निर्देशों को पढ़ने में बहुत कुशल हो गए हैं, जिससे यह पता चलता है कि विभिन्न ऊतक (tissues) कैसे कार्य करते हैं और बीमारियाँ कैसे शुरू होती हैं। यह दृष्टिकोण, जिसे सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग कहा जाता है, जीव विज्ञान में एक क्रांति लेकर आया है। हालाँकि, दुनिया के अधिकांश जीव मनुष्य या लैब के चूहे नहीं हैं। वे गैर-मॉडल जीव (non-model organisms) हैं, ऐसे प्राणी जिनका कभी प्रयोगशाला सेटिंग में अध्ययन नहीं किया गया है, जो अक्सर कठिन स्थानों पर या अन्य जानवरों के भीतर रहते हैं। इन जीवों के लिए, कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली मानक विधियाँ अक्सर विफल हो जाती हैं। उनके शरीर कठोर बाहरी परतों से सुरक्षित होते हैं, उन्हें आसानी से डिश में उगाया नहीं जा सकता है, और वैज्ञानिकों के पास अक्सर केवल तभी पहुंच होती है जब वे जम चुके होते हैं। इन जीवों के कोशिकीय स्तर पर अध्ययन करने का कोई तरीका न होने के कारण, उनके जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी तंत्र में उनकी भूमिका और वे बीमारी कैसे फैलाते हैं, इसकी हमारी समझ अधूरी रह जाती है।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस समस्या को हल करने के लिए हाथ डाला, विशेष रूप से परजीवी कृमियों (parasitic worms) के लिए, विशेष रूप से नेमाटोड्स (nematodes) के लिए, जो पशुधन और मनुष्यों में बीमारी का एक प्रमुख कारण हैं। ये कृमि एक कठोर, सुरक्षात्मक त्वचा द्वारा घिरे होते हैं जिसे क्यूटिकल (cuticle) कहा जाता है, जो उन्हें नाजुक आनुवंशिक सामग्री को नष्ट किए बिना तोड़ना अविश्वसनीय रूप से कठिन बना देता है। वैज्ञानिकों ने अन्य जीवों से नाभिक (nuclei)—जो कोशिकाओं के कमांड सेंटर होते हैं और जिनमें आनुवंशिक कोड होता है—को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली तीन मौजूदा विधियों का परीक्षण करके शुरुआत की। उन्होंने पाया कि ये मानक दृष्टिकोण परजीवी कृमियों के लिए अक्षम थे, क्योंकि वे अक्सर बिना पचे हुए ऊतकों के बड़े टुकड़ों को पीछे छोड़ देते थे या नाभिक को इतना नुकसान पहुँचाते थे कि आनुवंशिक जानकारी खो जाती थी। एक विधि, जो छोटे राउंडवॉर्म C. elegans के लिए डिज़ाइन की गई थी, बड़े परजीवी प्रजातियों को तोड़ने में विफल रही। दूसरी विधि, जिसे मानव ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया था, बहुत अधिक मलबा छोड़ देती थी। तीसरी विधि ने कुछ नाभिक प्राप्त किए लेकिन उनकी बाहरी झिल्लियों को नुकसान पहुँचाया, जिससे आनुवंशिक सामग्री बाहर निकल गई।
यह पहचानते हुए कि मौजूदा उपकरण इन विशिष्ट चुनौतियों के लिए नहीं बने थे, शोधकर्ताओं ने एक नई, अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित की जिसे उन्होंने SNIP नाम दिया। उनकी सफलता की कुंजी पूरी प्रक्रिया के दौरान कृमियों को जमा हुआ (frozen) रखना था। कृमियों को पिघलाने और बर्फ पर काटकर टुकड़ों में करने के बजाय, जिसमें आनुवंशिक सामग्री को नुकसान पहुँचने का जोखिम होता है, टीम ने प्री-चिल्ड (पहले से ठंडे किए गए) कैंची का उपयोग करके जमे हुए कृमियों को सीधे ट्यूब में छोटे टुकड़ों में काटा। सूक्ष्म लार्वा अवस्थाओं के लिए, उन्होंने ड्राई आइस द्वारा ठंडी की गई ओखली और मूसल (mortar and pestle) में जमे हुए कृमियों को पीसा। फिर उन्होंने ऊतकों को अलग करने के लिए कांच के मूसल के साथ विशिष्ट कोमल और दृढ़ प्रहारों का उपयोग किया, और नाभिकों को और अधिक पीसने से क्षतिग्रस्त होने से पहले सावधानीपूर्वक एकत्र किया। अंत में, उन्होंने मलबे के उन छोटे टुकड़ों को हटाने के लिए एक सॉर्टिंग मशीन का उपयोग किया जो पिछली विधियों में रुकावट पैदा करते थे, जिससे स्वस्थ नाभिकों का एक साफ सस्पेंशन (suspension) प्राप्त हुआ।
इस नए दृष्टिकोण के परिणाम आश्चर्यजनक थे। वयस्क मादा कृमियों पर परीक्षण करते समय, SNIP प्रोटोकॉल ने सर्वोत्तम तीन मौजूदा विधियों की तुलना में 1.7 से 4.1 गुना अधिक नाभिक प्राप्त किए। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इसके द्वारा उत्पादित नाभिकों में काफी अधिक आनुवंशिक सामग्री थी—मौजूदा सर्वश्रेष्ठ विधि की तुलना में प्रति नाभिक लगभग 3.2 गुना अधिक RNA। शोधकर्ताओं ने इस नई तकनीक को दो अलग-अलग परजीवी कृमि प्रजातियों, Haemonchus contortus और Trichuris muris, और दोनों नर और मादा कृमियों के लिए विभिन्न जीवन चरणों में मान्य किया। उन्होंने जमे हुए नमूनों से आनुवंशिक डेटा सफलतापूर्वक उत्पन्न किया, जिससे यह सिद्ध हुआ कि यह विधि लंबे समय तक रखे गए नमूनों के साथ भी काम करती है। यह लचीलापन अत्यंत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह वैज्ञानिकों को विभिन्न स्थानों और समय से नमूने एकत्र करने, उन्हें संग्रहीत करने और उन्हें एक साथ संसाधित करने की अनुमति देता है, जो उन तकनीकी त्रुटियों को दूर करता है जो आमतौर पर नमूनों को अलग-अलग संभालने के दौरान होती हैं।
इस नई विधि का उपयोग करते हुए, टीम इन परजीवियों के हजारों व्यक्तिगत नाभिकों की आनुवंशिक गतिविधि को पढ़ने में सक्षम थी। डेटा ने नर और मादा कृमियों के बीच, साथ ही वयस्क कृमियों और उनके लार्वा चरणों के बीच जीन गतिविधि में स्पष्ट अंतर प्रकट किया। उन्होंने समूहों की पहचान की जो विशिष्ट कार्यों के लिए विशेषीकृत प्रतीत होते थे, जैसे अंडे बनाने या शुक्राणु उत्पादन के लिए, और अन्य जो श्वसन या पाचन में शामिल लग रहे थे। हालांकि शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि उनके प्रारंभिक आनुवंशिक मानचित्र अभी भी कच्चे (rough) हैं और उन्हें और अधिक परिष्कृत करने की आवश्यकता है, यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि अब इन कठिन-से-अध्ययन वाले जीवों के लिए विस्तृत कोशिकीय एटलस (cellular atlases) बनाना संभव है। इन जमे हुए परजीवी कृमियों से नाभिक को अलग करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करके, यह कार्य उनके विकास, मेजबान के साथ उनकी अंतःक्रिया और संभावित रूप से उन्हें नियंत्रित करने के नए तरीके विकसित करने के बारे में गहरी समझ के द्वार खोलता है।
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