Scalable single-cell metagenomic analysis with Bascet and Zorn
यह शोध पत्र बास्केट (Bascet) और ज़ोर्न (Zorn) को प्रस्तुत करता है, जो एक स्केलेबल और पुनरुत्पादनीय बायोइन्फॉर्मेटिक टूलकिट है जिसे हाई-थ्रूपुट सिंगल-सेल मेटाजेनोमिक विश्लेषण में वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे मानव लार जैसे जटिल सूक्ष्मजीव समुदायों से उच्च-रिज़ॉल्यूशन जीनोम डेटा का निर्माण सक्षम होता है।
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सूक्ष्मजीवविज्ञानी लंबे समय से एक मौलिक सीमा का सामना कर रहे हैं: वे जंगल को देख सकते हैं, लेकिन व्यक्तिगत पेड़ों को नहीं। सूक्ष्मजीव समुदायों के अध्ययन की पारंपरिक विधियों, जिन्हें मेटाजीनोमिक्स कहा जाता है, में मिट्टी, पानी या लार के नमूने को पीसकर उसमें मौजूद सभी डीएनए को अनुक्रमित (sequence) किया जाता है। यह दृष्टिकोण वहां मौजूद चीजों का एक शक्तिशाली औसत प्रदान करता है, ठीक वैसे ही जैसे एक फलों के सलाद को पीसकर उसका रस बनाना और फिर यह अनुमान लगाना कि उसमें कौन से फल थे। हालांकि यह उपयोगी है, लेकिन यह विधि बैक्टीरिया के विभिन्न उपभेदों (strains) के बीच की रेखाओं को धुंधला कर देती है, कम संख्या में मौजूद दुर्लभ प्रजातियों को छिपा देती है, और विशिष्ट जीन को उस सटीक कोशिका से जोड़ना असंभव बना देती है जो उन्हें वहन करती है। सूक्ष्मजीवों की इस जटिल, अदृश्य दुनिया को वास्तव में समझने के लिए, वैज्ञानिकों को प्रत्येक बैक्टीरिया को व्यक्तिगत रूप से, एक-एक करके देखने के तरीके की आवश्यकता है ताकि उसके अद्वितीय आनुवंशिक मेकअप को देखा जा सके।
वर्षों तक, यह स्तर अत्यधिक महंगा और धीमा था, जो एक बार में केवल कुछ दर्जन कोशिकाओं के विश्लेषण तक सीमित था। हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक्स—तरल की छोटी बूंदों के हेरफेर के विज्ञान—में हालिया प्रगति ने एक ही प्रयोग में लाखों कोशिकाओं को संसाधित करने का द्वार खोल दिया है। चुनौती डेटा उत्पन्न करने की नहीं थी, बल्कि उसे समझने की थी। इन नई उच्च-थ्रूपुट (high-throughput) विधियों द्वारा उत्पन्न सूचना की विशाल मात्रा मानक कंप्यूटर प्रोग्रामों को अभिभूत कर देगी, जिससे एक डिजिटल बाधा (bottleneck) पैदा होगी जो शोधकर्ताओं को इन विशाल डेटासेट की खोज करने से रोकती है। स्वीडन के उमेआ विश्वविद्यालय की एक टीम का एक नया अध्ययन इस बाधा को दूर करने के लिए एक पूर्ण सॉफ्टवेयर टूलकिट पेश करके इस समस्या का समाधान करता है, जो आधुनिक सिंगल-सेल माइक्रोबियल अनुक्रमण (sequencing) के पैमाने को संभालने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे वैज्ञानिक अंततः अभूतपूर्व स्पष्टता के साथ सूक्ष्मजीव समुदायों की आनुवंशिक विविधता का मानचित्रण कर सकते हैं।
शोधकर्ताओं ने, जिनका नेतृत्व हेड्रिएन गौर्ले, इरिना याकोवेनको और उनके सहयोगियों ने किया, इस समस्या को हल करने के लिए एक दो-भाग वाली प्रणाली विकसित की। पहला भाग, जिसे बासेट (Bascet) कहा जाता है, एक शक्तिशाली कमांड-लाइन प्रोग्राम है जो एक तेज़, कुशल कोडिंग भाषा में लिखा गया है। यह एक 'हेवी लिफ्टर' के रूप में कार्य करता है, जो लाखों कोशिकाओं से कच्चे अनुक्रमण डेटा को लेता है और उसे एक प्रबंधनीय प्रारूप में व्यवस्थित करता है। दूसरा भाग, ज़ोर्न (Zorn), एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस है जो वैज्ञानिकों को जटिल कोड लिखे बिना डेटा का पता लगाने, दृश्य बनाने (visualize) और विश्लेषण करने की अनुमति देता है। साथ मिलकर, ये उपकरण एक ऐसा वर्कफ़्लो सक्षम करते हैं जो एक ही रन में दस लाख से अधिक कोशिकाओं के डेटा को संसाधित कर सकता है, एक ऐसा पैमाना जो मानक बायोइन्फॉर्मेटिक्स सॉफ्टवेयर के लिए पहले असंभव था। टीम ने दस ज्ञात जीवाणु प्रजातियों के एक 'मॉक कम्युनिटी' और, अधिक महत्वपूर्ण रूप से, मानव लार के एक वास्तविक नमूने पर इसे लागू करके इस प्रणाली की शक्ति का प्रदर्शन किया।
डेटा उत्पन्न करने के लिए, टीम ने अर्ध-पारगम्य कैप्सूल (semi-permeable capsules) का उपयोग करते हुए एक नवीन प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग किया। ये छोटी, लचीली कंटेनर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं को फँसा लेती हैं, जिससे शोधकर्ता उन्हें बिना एक-दूसरे के साथ मिले तोड़ सकते हैं और उनके भीतर डीएनए को प्रवर्धित (amplify) कर सकते हैं। एक बार डीएनए प्रवर्धित हो जाने के बाद, इसे एक अद्वितीय बारकोड के साथ टैग किया जाता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि आनुवंशिक सामग्री के प्रत्येक टुकड़े को मूल कोशिका तक वापस ट्रैक किया जा सके। टीम ने डीएनए को प्रवर्धित करने के लिए दो अलग-अलग विधियों का परीक्षण किया। उन्होंने पाया कि एक नई, अधिक सटीक विधि जिसे 'प्राइमरी टेम्पलेट-डायरेक्टेड एम्प्लीफिकेशन' कहा जाता है, ने पुरानी, अधिक सामान्य विधि की तुलना में बहुत अधिक समान और विश्वसनीय परिणाम दिए, जो कि पुरानी विधि में जीनोम के कुछ हिस्सों को अन्य हिस्सों की तुलना में बहुत अधिक प्रवर्धित करने की प्रवृत्ति थी। यह खोज बताती है कि यदि शोधकर्ता एकल कोशिकाओं से उच्च-गुणवत्ता वाला डेटा चाहते हैं तो उन्हें पुरानी तकनीक से दूर हट जाना चाहिए।
जब टीम ने अपने नए सॉफ्टवेयर को मानव लार के नमूने पर लागू किया, तो परिणाम चौंकाने वाले थे। उन्होंने 15,000 से अधिक व्यक्तिगत प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं से पूर्ण आनुवंशिक ब्लूप्रिंट, जिन्हें सिंगल-एम्प्लीफाइड जीनोम कहा जाता है, सफलतापूर्वक उत्पन्न किए। इस स्तर के रिज़ॉल्यूशन ने उन विवरणों को प्रकट किया जो पारंपरिक बल्क अनुक्रमण (bulk sequencing) में पूरी तरह से अदृश्य थे। उदाहरण के लिए, मानक विधि ने मसूड़ों की बीमारी से जुड़े एक विशिष्ट, अनकल्चरड (uncultured) प्रकार के बैक्टीरिया, जिसे Tannerella sp. ओरल टैक्सोन 808 के रूप में जाना जाता है, को मिस कर दिया। हालांकि, सिंगल-सेल दृष्टिकोण ने न केवल इस दुर्लभ जीव का पता लगाया, बल्कि इसकी एक नई वंशावली (lineage) को भी उजागर किया जिसे पहले कभी नहीं देखा गया था। यह नई वंशावली बैक्टीरिया के अन्य ज्ञात संस्करणों से अलग दिखाई देती है, जो एक आनुवंशिक अंतर दिखाती है जो मिश्रित नमूने में खो जाता। इसके अलावा, विश्लेषण ने सुझाव दिया कि ये बैक्टीरिया भौगोलिक रूप से जुड़े हो सकते हैं, जिसमें दुनिया के विभिन्न हिस्सों में अलग-अलग आनुवंशिक वेरिएंट हावी हैं।
अध्ययन ने पूर्व-मौजूदा ज्ञात जीनोम की लाइब्रेरी पर निर्भर किए बिना डेटा को संभालने की सॉफ्टवेयर की क्षमता पर भी प्रकाश डाला। कई मामलों में, वैज्ञानिकों को ठीक से पता नहीं होता कि नमूने में कौन सी प्रजातियां हैं, जिससे उन पारंपरिक उपकरणों का उपयोग करना कठिन हो जाता है जिन्हें संदर्भ मानचित्र (reference map) की आवश्यकता होती है। नए टूलकिट में अभिनव विधियाँ शामिल हैं जो सीधे उनके आनुवंशिक पैटर्न के आधार पर कोशिकाओं की तुलना करती हैं, जिससे शोधकर्ता समान कोशिकाओं को एक साथ समूहित कर सकते हैं और अंतर का पता लगा सकते हैं, भले ही विशिष्ट प्रजातियां अज्ञात हों। यह क्षमता "माइक्रोबियल डार्क मैटर"—उस विशाल संख्या में अनकल्चरड और अनकैरेक्टराइज्ड सूक्ष्मजीवों—की खोज के लिए महत्वपूर्ण है जो ग्रह की अधिकांश जैव विविधता बनाते हैं।
एक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगशाला विधि को एक स्केलेबल कम्प्यूटेशनल फ्रेमवर्क के साथ जोड़कर, शोधकर्ताओं ने सूक्ष्मजीव विज्ञान में प्रवेश की एक बड़ी बाधा को हटा दिया है। उनका कार्य दिखाता है कि अब एक ही प्रयोग में उतने सूक्ष्मजीव जीनोम उत्पन्न करना संभव है जितने वर्तमान में सभी सार्वजनिक डेटाबेस में मौजूद हैं। औसत का अध्ययन करने से लेकर व्यक्तिगत का अध्ययन करने की ओर यह बदलाव बैक्टीरिया के विकास, मेजबानों के साथ उनकी अंतःक्रिया और मानव स्वास्थ्य एवं रोग में उनके योगदान को समझने के नए रास्ते खोलता है। ये उपकरण ओपन-सोर्स हैं और मुफ्त में उपलब्ध हैं, जो वैश्विक वैज्ञानिक समुदाय को उस रिज़ॉल्यूशन पर माइक्रोबायोम की खोज करने के लिए आमंत्रित करते हैं जो कभी विज्ञान कथा (science fiction) का हिस्सा हुआ करता था।
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