Scalable single-cell metagenomic analysis with Bascet and Zorn

Microbiologen worden al lang geconfronteerd met een fundamentele beperking: ze kunnen het bos zien, maar niet de individuele bomen. Traditionele methoden voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen, bekend als metagenomica, houden in dat een monster van bodem, water of speeksel wordt vermalen en alle aanwezige DNA wordt gesequenced. Deze aanpak biedt een krachtig gemiddelde van wat aanwezig is, vergelijkbaar met het blenderen van een fruitsalade en het analyseren van het resulterende sap om te raden welke vruchten erin zaten. Hoewel dit nuttig is, vervaagt deze methode de grenzen tussen verschillende stammen van bacteriën, verbergt het zeldzame soorten die in lage aantallen voorkomen, en maakt het het onmogelijk om specifieke genen te koppelen aan de exacte cel die ze draagt. Om de complexe, onzichtbare wereld van microben echt te begrijpen, hebben wetenschappers een manier nodig om elke bacterie afzonderlijk te bekijken, één voor één, om hun unieke genetische opbouw te zien.

Jarenlang was dit niveau van detail evenredig duur en traag, beperkt tot het analyseren van slechts enkele tientallen cellen tegelijk. Recente vooruitgang in microfluïdica — de wetenschap van het manipuleren van minuscule druppeltjes vloeistof — heeft echter de deur geopend naar het verwerken van miljoenen cellen in één enkel experiment. De uitdaging was niet langer het genereren van de data, maar het begrijpen ervan. Het enorme volume aan informatie dat door deze nieuwe high-throughput-methoden wordt geproduceerd, zou standaard computerprogramma's overweldigen, wat een digitale flessenhals creëerde die onderzoekers verhinderde deze enorme datasets te verkennen. Een nieuwe studie van een team aan de Umeå Universiteit in Zweden pakt deze barrière aan door een compleet softwarepakket te introduceren dat is ontworpen om de schaal van moderne single-cell microbiële sequencing aan te kunnen, waardoor wetenschappers de genetische diversiteit van microbiële gemeenschappen eindelijk met ongekende helderheid in kaart kunnen brengen.

De onderzoekers, onder leiding van Hadrien Gourlé, Iryna Yakovenko en hun collega's, ontwikkelden een tweeledig systeem om dit probleem op te lossen. Het eerste deel, genaamd Bascet, is een krachtig command-line programma geschreven in een snelle, efficiënte programmeertaal. Het fungeert als de zware krachtpatser, die ruwe sequencingdata van miljoenen cellen neemt en deze organiseert in een hanteerbaar formaat. Het tweede deel, Zorn, is een gebruiksvriendelijke interface waarmee wetenschappers de data kunnen verkennen, visualiseren en analyseren zonder complexe code te hoeven schrijven. Samen maken deze tools een workflow mogelijk die data van meer dan een miljoen cellen in één enkele run kan verwerken, een schaal die voorheen onmogelijk was voor standaard bio-informatica software. Het team demonstreerde de kracht van dit systeem door het toe te passen op een mock-community van tien bekende bacteriesoorten en, nog belangrijker, op een echt monster van menselijk speeksel.

Om de data te genereren, gebruikte het team een nieuwe laboratoriumtechniek waarbij gebruik wordt gemaakt van semi-permeabele capsules. Deze minuscule, flexibele containers vangen individuele bacteriële cellen op, waardoor onderzoekers ze kunnen openbreken en hun DNA binnenin kunnen amplificeren zonder dat de cellen met elkaar mengen. Zodra het DNA is geamplificeerd, wordt het voorzien van een unieke barcode, wat ervoor zorgt dat elk stuk genetisch materiaal kan worden teruggevoerd naar de oorspronkelijke cel. Het team testte twee verschillende methoden voor het amplificeren van het DNA. Ze ontdekten dat een nieuwere, preciezere methode genaamd primary template-directed amplification veel gelijkmatigere en betrouwbaardere resultaten produceerde dan de oudere, meer gangbare methode, die de neiging had om bepaalde delen van het genoom veel meer te amplificeren dan andere. Deze ontdekking suggereert dat onderzoekers af moeten stappen van de oudere techniek als ze hoogwaardige data van single cells willen verkrijgen.

Toen het team hun nieuwe software toepaste op een monster van menselijk speeksel, waren de resultaten opmerkelijk. Ze slaagden erin volledige genetische blauwdrukken, ook wel single-amplified genomes genoemd, te genereren van meer dan 15.000 individuele prokaryotische cellen. Dit niveau van resolutie onthulde details die volledig onzichtbaar waren voor traditionele bulk-sequencing. Zo miste de standaardmethode een specifiek, ongecultiveerd type bacterie geassocieerd met tandvleesziekte, bekend als Tannerella sp. oral taxon 808. Echter, de single-cell benadering detecteerde niet alleen deze zeldzame organisme, maar ontdekte ook een nieuwe lijn van deze bacterie die nog nooit eerder was gezien. Deze nieuwe lijn leek af te wijken van andere bekende versies van de bacterie, wat een genetisch verschil vertoonde dat verloren zou zijn gegaan in een gemengd monster. Bovendien suggereerde de analyse dat deze bacteriën geografisch verbonden zouden kunnen zijn, waarbij verschillende genetische varianten in verschillende delen van de wereld domineren.

De studie benadrukte ook het belang van het vermogen van de software om data te verwerken zonder te vertrouwen op een vooraf bestaande bibliotheek van bekende genomen. In veel gevallen weten wetenschappers niet precies welke soorten in een monster aanwezig zijn, wat het gebruik van traditionele tools die een referentiemap vereisen bemoeilijkt. De nieuwe toolkit bevat innovatieve methoden die cellen direct op basis van hun genetische patronen vergelijken, waardoor onderzoekers vergelijkbare cellen bij elkaar kunnen groeperen en verschillen kunnen spotten, zelfs wanneer de specifieke soorten onbekend zijn. Deze capaciteit is cruciaal voor het verkennen van de "microbiële donkere materie" — het enorme aantal ongecultiveerde en ongekarakteriseerde microben die het grootste deel van de biodiversiteit van de planeet vormen.

Door een high-throughput laboratoriummethode te combineren met een schaalbaar computationeel framework, hebben de onderzoekers een belangrijke barrière in de microbiële wetenschap weggenomen. Hun werk toont aan dat het nu mogelijk is om in één enkel experiment evenveel microbiële genomen te genereren als er momenteel in alle publieke databases samen bestaan. Deze verschuiving van het bestuderen van het gemiddelde naar het bestuderen van het individu opent nieuwe wegen voor het begrijpen van hoe bacteriën evolueren, hoe ze interageren met hun gastheren en hoe ze bijdragen aan de menselijke gezondheid en ziekte. De tools zijn open-source en gratis beschikbaar, een uitnodiging aan de wereldwijde wetenschappelijke gemeenschap om de microbiomen te gaan verkennen op een resolutie die ooit het domein van sciencefiction was.