Structure-based recasting of a mammalian DNA transpososomeas an obligate heterodimer

अपने जीनोम की कल्पना एक विशाल, हलचल भरी लाइब्रेरी के रूप में करें जिसमें एक इंसान को बनाने और चलाने के निर्देश मैनुअल रखे गए हैं। कभी-कभी, टूटे हुए निर्देशों को ठीक करने या नई विशेषताएं जोड़ने के लिए हमें इन किताबों में नए अध्याय डालने की आवश्यकता होती है—एक प्रक्रिया जिसे जीन थेरेपी कहा जाता है। इस काम के लिए सबसे आशाजनक उपकरणों में से एक "कट-एंड-पेस्ट" जेनेटिक कैंची है जिसे ट्रांसपोज़ेज (transposase) कहा जाता है। एक ट्रांसपोज़ेज को एक आणविक डिलीवरी ट्रक के रूप में सोचें: यह डीएनए के एक विशिष्ट पैकेज (कार्गो) को पकड़ता है और उसे लाइब्रेरी में एक नई जगह पर ले जाता है। हालाँकि, इसमें एक पेच है। अधिकांश ये ट्रक थोड़े लापरवाह होते हैं; उनके पास जीपीएस (GPS) नहीं होता है। वे लाइब्रेरी में इधर-उधर भटकते हैं और अपने पैकेज को यादृच्छिक (random) स्थानों पर छोड़ देते हैं। यदि वे किसी महत्वपूर्ण निर्देश मैनुअल के बीच में उतर जाते हैं, तो वे किताब को खराब कर सकते हैं, जिससे कैंसर जैसी गंभीर समस्याएं हो सकती हैं। वैज्ञानिक इन ट्रकों से एक जीपीएस (एक लक्ष्य निर्धारण प्रणाली) जोड़ने की कोशिश कर रहे हैं, लेकिन ट्रक खुद इस तरह से बनाए गए हैं कि यह करना अविश्वसनीय रूप से कठिन है। वे आमतौर पर समान जुड़वा बच्चों या चतुर्भुज (quadruplets) की टीमों के रूप में आते हैं, जो एक ही निर्देश चिल्ला रहे होते हैं, जिससे लक्ष्य निर्धारण प्रणाली भ्रमित हो जाती है। बड़ा सवाल यह था: क्या हम इन आणविक ट्रकों को फिर से डिज़ाइन कर सकते हैं ताकि वे केवल एक विशिष्ट, सुरक्षित पते पर ही चलें?

यह शोध पत्र बताता है कि वैज्ञानिकों ने एक विशेष चमगादड़ में पाए जाने वाले बहुत ही खास डिलीवरी ट्रक का बारीकी से अध्ययन करके इस पहेली को कैसे हल किया। एक शक्तिशाली सूक्ष्मदर्शी जिसे क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryo-electron microscopy) कहा जाता है, का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने चमगादड़ के "पिगीबैट" (piggyBat) ट्रांसपोज़ेज का एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3D स्नैपशॉट लिया, जबकि वह अपने काम के बीच में था। उन्होंने पाया कि यह ट्रक अन्य प्रजातियों में देखी जाने वाली सममित (symmetrical), समान टीमों जैसा नहीं दिखता है। इसके बजाय, यह चार भागों वाली एक अनूठी, अर्धचंद्राकार (crescent-shaped) टीम के रूप में जुड़ता है जो वास्तव में एक साथ दो बहुत अलग काम कर रहे हैं। दो भाग "ड्राइवर" हैं जो डीएनए को काटते और चिपकाते हैं, जबकि अन्य दो भाग "स्थिरीकरण करने वाले" (stabilizers) के रूप में कार्य करते हैं जो पैकेज को एक साथ थामे रखते हैं लेकिन उन्हें बंद रखा जाता है ताकि वे गलती से गलत चीज़ को न काट दें। यही विषमता (asymmetry) इसकी कुंजी है। क्योंकि यह ट्रक इस तरह से बनाया गया है, वैज्ञानिकों ने महसूस किया कि वे इस टीम को तोड़ सकते हैं और इसे एक कस्टम "हेटरोडाइमर" (heterodimer) के रूप में फिर से बना सकते हैं—एक ऐसी टीम जो दो अलग-अलग, विशिष्ट भागों से बनी हो। इन दोनों भागों को केवल एक साथ काम करने के लिए और अपने आप के साथ काम न करने के लिए इंजीनियर करके, और उनमें दो अलग-अलग जीपीएस यूनिट (जिन्हें TALEs कहा जाता है) जोड़कर, उन्होंने एक ऐसा डिलीवरी सिस्टम बनाया जो अविश्वसनीय रूप से सटीक है। अपने परीक्षणों में, इस नए सिस्टम ने मानव कोशिकाओं में इच्छित लक्ष्य स्थान पर सफलतापूर्वक डीएनए वितरित किया, जिसने प्रभावी रूप से एक लापरवाह डिलीवरी ट्रक को एक निर्देशित मिसाइल में बदल दिया जो केवल लक्ष्य पर ही प्रहार करती है।

शोधकर्ताओं ने मायोटिस लुसिफगस (Myotis lucifugus) चमगादड़ का अध्ययन करके शुरुआत की, जो अपने जीनोम में एक सक्रिय डीएनए ट्रांसपोज़न रखने वाला एकमात्र स्तनपायी ज्ञात है। उन्होंने इस ट्रांसपोज़ेज का एक "हाइपरएक्टिव" संस्करण इंजीनियर किया ताकि यह मानव कोशिकाओं में बेहतर काम कर सके। यह समझने के लिए कि यह कैसे काम करता है, उन्होंने कॉम्प्लेक्स को काम के ठीक बाद फ्रीज कर दिया जब इसने डीएनए कार्गो को एक लक्ष्य स्थल से जोड़ा था, जिसे वे "स्ट्रैंड ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स" कहते हैं। जब उन्होंने इसकी संरचना को देखा, तो वे हैरान रह गए कि यह कॉम्प्लेक्स कई अन्य आणविक मशीनों की तरह एक सममित वृत्त या वर्ग नहीं था। इसके बजाय, इसने एक मुड़ा हुआ, अर्धचंद्राकार आकार बनाया। टीम चार प्रोटीन इकाइयों (एक टेट्रामर) से बनी है, लेकिन वे सभी एक जैसा काम नहीं कर रहे हैं।

संरचना ने श्रम के एक दिलचस्प विभाजन को प्रकट किया। "बाहरी" डाइमर (प्रोटीन का एक जोड़ा) सक्रिय इंजन है। यह डीएनए के सिरों को थामता है और रासायनिक कट और पेस्ट करता है। हालाँकि, "आंतरिक" डाइमर, उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय (catalytically inactive) है; यह डीएनए को बिल्कुल नहीं काटता है। इसका काम एक संरक्षक के रूप में कार्य करना है। यह डीएनए से इस तरह बंधता है कि यह आंतरिक प्रोटीनों के सक्रिय स्थलों को डीएनए बैकबोन को छूने से भौतिक रूप से रोकता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि ट्रक गलती से अपने ही कार्गो को न फाड़ दे। शोधकर्ताओं ने पाया कि बाहरी हिस्से में डीएनए काफी तीखा मुड़ा हुआ है लेकिन आंतरिक हिस्से में अपेक्षाकृत सीधा रहता है। आकार का यह अंतर आंतरिक प्रोटीनों को एक "संरक्षक" मुद्रा अपनाने के लिए मजबूर करता है, जिससे डीएनए सुरक्षित रहता है। यह स्पष्ट करता है कि ट्रक को चार भागों की आवश्यकता क्यों है: दो काम करने के लिए और दो यह सुनिश्चित करने के लिए कि काम पैकेज को नष्ट न कर दे।

इस ब्लूप्रिंट को हाथ में लेकर, वैज्ञानिकों ने ट्रक को फिर से डिज़ाइन करने का निर्णय लिया। उनका लक्ष्य ट्रक को समान जुड़वा बच्चों (homodimers) की टीमें बनाने से रोकना था, जो पहले उल्लेखित लक्ष्य निर्धारण भ्रम का कारण बनता है। उन्होंने प्रोटीन की सतह पर विशिष्ट "गोंद" बिंदुओं की पहचान की जहाँ दो समान आधे हिस्से आपस में चिपक जाते हैं। कुछ अमीनो एसिड (प्रोटीन के निर्माण खंड) को इन गोंद बिंदुओं पर बदलकर, उन्होंने प्रोटीन के दो संस्करण बनाए: एक जिसमें गोंद वाले स्थान पर धनात्मक (positive) चार्ज था, और दूसरा जिसमें ऋणात्मक (negative) चार्ज था। दो चुंबकों के समान ध्रुवों के एक दूसरे को प्रतिकर्षित करने की तरह, ये दोनों संस्करण अपने ही प्रकार के साथ चिपकने से इनकार कर देंगे। वे केवल एक दूसरे के साथ चिपकेंगे, जिससे दो अलग-अलग प्रोटीनों के बीच एक मजबूर साझेदारी बनेगी। इसने एक "ओब्लिगेट हेटरोडाइमर" (obligate heterodimer) बनाया—एक ऐसी टीम जिसे कार्य करने के लिए दो अलग-अलग भागों से बना होना ही चाहिए।

इस नए टीम को और भी सटीक बनाने के लिए, उन्होंने दो अलग-अलग प्रोटीन आधे हिस्सों पर दो अलग-अलग जीपीएस यूनिट, जिन्हें TALE डोमेन कहा जाता है, जोड़े। इन TALEs को मानव जीनोम में एक सुरक्षित हार्बर साइट (एक स्थान जिसे नया जीन डालने के लिए सुरक्षित माना जाता है) के आसपास के विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों को पहचानने के लिए डिज़ाइन किया गया था। हालाँकि, इसमें एक और महत्वपूर्ण सुरक्षा विशेषता जोड़ी गई थी। जीपीएस के साथ भी, ट्रक की एक आदत थी कि यदि वह डीएनए के बहुत करीब पहुँच जाता है, तो वह यादृच्छिक स्थानों पर पैकेज गिरा देता है। इसे रोकने के लिए, वैज्ञानिकों ने R336A नामक एक विशिष्ट उत्परिवर्तन (mutation) पेश किया। इस उत्परिवर्तन को एक "गैर-विशिष्ट बाइंडिंग ब्रेक" (non-specific binding brake) के रूप में समझें। यह ट्रक को सही लक्ष्य पर काटने और चिपकाने से नहीं रोकता है, लेकिन यह किसी भी पास के डीएनए को पकड़ने की इसकी क्षमता को काफी कम कर देता है। यह सुनिश्चित करता है कि ट्रक डीएनए को केवल तभी एकीकृत करे जब जीपीएस इकाइयाँ सफलतापूर्वक इच्छित लक्ष्य पर लॉक हो जाएं, न कि केवल पास के किसी भी डीएनए से टकराकर।

शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं में इस नए सिस्टम का परीक्षण किया। जब उन्होंने केवल संशोधित प्रोटीन का उपयोग किया, तो कुछ नहीं हुआ। लेकिन जब उन्होंने दोनों संस्करणों को मिलाया, तो ट्रक असेंबल हुआ, जीपीएस इकाइयाँ लक्ष्य पर लॉक हो गईं, और गैर-विशिष्ट बाइंडिंग ब्रेक सक्रिय हो गया।

परिणाम आश्चर्यजनक थे। एक परीक्षण में जहाँ लक्षित डीएनए को एक प्लास्मिड (एक छोटा गोलाकार डीएनए अणु) पर रखा गया था, नए हेटरोडाइमर सिस्टम ने 98.4% बार सही स्थान पर एकीकरण निर्देशित किया। इसके विपरीत, अनमॉडिफाइड सिस्टम या स्कैम्बल किए गए जीपीएस वाले सिस्टम ने उपलब्ध किसी भी स्थान में यादृच्छिक एकीकरण किया। इसके अलावा, जब उन्होंने वास्तविक मानव कोशिकाओं (HEK293T) में इसका परीक्षण किया, तो उन्होंने पुष्टि की कि डीएनए को गुणसूत्र 6 (chromosome 6) पर इच्छित स्थान पर सटीक रूप से डाला गया था। यह शोध पत्र सुझाव देता है कि यह दृष्टिकोण जीन थेरेपी में एक बड़ी सुरक्षा बाधा को हल करता है: "ऑफ-टारगेट" एकीकरण का जोखिम। ट्रांसपोज़ेज को हेटरोडाइमर के रूप में कार्य करने के लिए मजबूर करके, जिसके लिए दो अलग-अलग लक्ष्य निर्धारण डोमेन का एक साथ बंधना आवश्यक है, और यादृच्छिक पकड़ को दबाने के लिए R336A उत्परिवर्तन जोड़कर, यह सिस्टम सुनिश्चित करता है कि एकीकरण केवल वहीं हो जहाँ वैज्ञानिक चाहते हैं, उस स्तर की सटीकता के साथ जो इस प्रकार के आणविक उपकरणों के लिए पहले प्राप्त करना कठिन था। लेखक नोट करते हैं कि हालांकि यह एक महत्वपूर्ण कदम है, लेकिन विभिन्न सेल प्रकारों और विभिन्न लक्ष्य निर्धारण डोमेन के साथ परीक्षण करने के लिए और अधिक काम करने की आवश्यकता है, लेकिन उनके द्वारा प्रदान किया गया संरचनात्मक ब्लूप्रिंट सुरक्षित, अधिक प्रभावी जीन वितरण प्रणाली डिजाइन करने का एक स्पष्ट मार्ग प्रदान करता है।