Structure-based recasting of a mammalian DNA transpososomeas an obligate heterodimer

당신의 게놈을 인간을 만들고 운영하기 위한 지침 설명서가 가득 담긴 거대하고 북적이는 도서관이라고 상상해 보십시오. 때때로 우리는 고장 난 지침을 고치거나 새로운 기능을 추가하기 위해 이 책들에 새로운 장을 삽입해야 할 때가 있는데, 이 과정을 유전자 치료라고 합니다. 이 작업에 가장 유망한 도구 중 하나는 '자르고 붙이기'를 수행하는 유전적 가위인 트랜스포사제(transposase)입니다. 트랜스포사제를 분자 배달 트럭이라고 생각하십시오. 이 트럭은 특정 DNA 패키지(화물)를 움켜쥐고 도서관의 새로운 위치로 운전해 갑니다. 하지만 함정이 있습니다. 대부분의 이 트럭들은 다소 무모합니다. GPS가 없기 때문입니다. 그들은 도서관을 배회하다가 아무 데나 화물을 떨어뜨립니다. 만약 그들이 중요한 지침 설명서 중간에 착륙한다면, 책을 망가뜨릴 수 있으며, 이는 암과 같은 심각한 문제로 이어질 수 있습니다. 과학자들은 이 트럭에 GPS(표적 시스템)를 부착하려고 노력해 왔지만, 트럭 자체가 매우 어렵게 만들어져 있습니다. 이들은 보통 동일한 쌍둥이나 네쌍둥이 팀으로 구성되어 똑같은 명령을 외치기 때문에 표적 시스템을 혼란스럽게 만듭니다. 큰 질문은 이것이었습니다. 우리가 이 분자 트럭을 설계하여 오직 하나의 특정하고 안전한 주소로만 운전하게 만들 수 있을까?

이 논문은 과학자들이 박쥐에서 발견된 매우 특별한 배달 트럭을 자세히 조사함으로써 이 퍼즐을 어떻게 풀었는지에 대한 이야기를 들려줍니다. 연구진은 강력한 현미경인 초저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy)을 사용하여, 박쥐의 "피기뱃(piggyBat)" 트랜스포사제가 작업 중인 모습을 고해상도 3D 스냅샷으로 촬영했습니다. 그들은 이 트럭이 다른 종에서 보이는 대칭적이고 동일한 팀과는 다르게 생겼다는 것을 발견했습니다. 대신, 이들은 두 가지 서로 다른 일을 동시에 수행하는 네 개의 부분으로 이루어진 독특한 초승달 모양의 팀으로 조립됩니다. 두 부분은 DNA를 자르고 붙이는 "운전자" 역할을 하고, 나머지 두 부분은 화물을 결합 상태로 유지하지만 실수로 잘못된 것을 자르지 않도록 꺼져 있는 "안정화 장치" 역할을 합니다. 이러한 비대칭성이 핵심입니다. 트럭이 이런 방식으로 구축되었기 때문에, 연구진은 이 팀을 해체하고 맞춤형 "헤테로다이머(heterodimer)"—즉, 두 개의 서로 다른 전문화된 부분으로 구성된 팀—로 재조립할 수 있다는 것을 깨달았습니다. 이 두 부분을 서로만 작동하고 자기 자신과는 작동하지 않도록 공학적으로 설계하고, 두 개의 서로 다른 GPS 유닛(TALE라고 불리는)을 부착함으로써, 그들은 믿을 수 없을 정도로 정밀한 배달 시스템을 만들었습니다. 테스트에서 이 새로운 시스템은 인간 세포 내에서 의도한 표적 지점으로 DNA를 98% 이상의 확률로 성공적으로 전달했습니다. 즉, 무모한 배달 트럭을 목표물을 정확히 타격하는 유도 미사일로 바꾼 것입니다.

연구진은 Myotis lucifugus(밝은꼬리박쥐)를 연구하는 것부터 시작했습니다. 이 박쥐는 게놈 안에 활성화된 DNA 트랜스포존을 가진 것으로 알려진 유일한 포유류입니다. 그들은 인간 세포에서 더 잘 작동하도록 이 트랜스포사제의 "과활성(hyperactive)" 버전을 설계했습니다. 이것이 어떻게 작동하는지 이해하기 위해, 그들은 복합체가 표적 부위에 DNA 화물을 부착한 직후의 상태로 얼려 "가닥 전이 복합체(strand transfer complex)"를 만들었습니다. 구조를 살펴보았을 때, 그들은 이 복합체가 많은 분자 기계들처럼 대칭적인 원형이나 사각형이 아니라는 사실에 놀랐습니다. 대신, 그것은 굽은 초승달 모양을 형성했습니다. 팀은 네 개의 단백질 단위(사량체)로 구성되어 있지만, 모두가 같은 일을 하는 것은 아닙니다.

구조는 매혹적인 분업을 드러냈습니다. "외부" 다이머(한 쌍의 단백질)는 활성 엔진입니다. 이것은 DNA 끝을 잡고 화학적인 절단과 붙이기를 수행합니다. 그러나 "내부" 다이머는 촉매적으로 비활성 상태입니다. 즉, DNA를 전혀 자르지 않습니다. 내부 단백질의 역할은 수호자 역할을 하는 것입니다. 그것은 DNA에 결합하여 내부 단백질의 활성 부위가 DNA 골격에 닿는 것을 물리적으로 차단함으로써, 트럭이 자신의 화물을 실수로 찢어버리는 것을 방지합니다. 연구진은 외부 섹션에서는 DNA가 급격히 휘어져 있지만, 내부 섹션에서는 비교적 직선을 유지한다는 것을 발견했습니다. 이러한 형태의 차이는 내부 단백질이 "수호자" 자세를 취하도록 강제하며, 화물을 안전하게 보호합니다. 이것이 왜 트럭에 네 개의 부품이 필요한지를 설명해 줍니다. 두 개는 작업을 수행하고, 나머지 두 개는 작업이 패키지를 파괴하지 않도록 보장하기 위해서입니다.

이 청사진을 손에 쥔 연구진은 트럭을 재설계하기로 결정했습니다. 그들의 목표는 트럭이 동일한 쌍둥이(동종 다이머) 팀을 형성하는 것을 막는 것이었습니다. 이는 앞서 언급한 표적 혼란을 일으키는 원인입니다. 그들은 두 개의 동일한 절반이 서로 달라붙는 단백질 표면의 특정 "접착" 지점들을 식별했습니다. 몇 개의 아미노산(단백질의 구성 요소)을 이 접착 지점에서 교체함으로써, 그들은 양전하를 가진 버전과 음전하를 가진 버전이라는 두 가지 버전의 단백질을 만들었습니다. 마치 같은 극을 가진 두 자석이 서로 밀어내는 것처럼, 이 두 버전은 자기 종류와는 붙기를 거부할 것입니다. 그들은 오직 서로에게만 붙어, 두 개의 서로 다른 부분으로 구성된 강제된 파트너십을 형성할 것입니다. 이를 통해 "의무적 헤테로다이머(obligate heterodimer)"—즉, 반드시 두 개의 서로 다른 부분으로 만들어져야 기능하는 팀—를 만들어냈습니다.

이 새로운 팀을 더욱 정밀하게 만들기 위해, 그들은 두 개의 서로 다른 단백질 절반에 TALE 도메인이라고 알려진 두 개의 서로 다른 GPS 유닛을 부착했습니다. 이 TALE들은 인간 게놈의 "세이프 하버(safe harbor)" 사이트(새로운 유전자를 삽입하기에 안전하다고 알려진 위치) 주변에 있는 특정 DNA 서열을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 그들은 한 가지 더 중요한 안전 장치를 추가했습니다. GPS가 있더라도, 트럭은 여전히 DNA 근처에 가면 무작위로 패키지를 떨어뜨리는 습성이 있었습니다. 이를 막기 위해, 과학자들은 R336A라고 불리는 특정 돌연변이를 도입했습니다. 이 돌연변이를 "비특이적 결합 브레이크"라고 생각하십시오. 이것은 트럭이 올바른 표적에서 자르고 붙이는 것을 막지는 않지만, 무작위 DNA 서열을 움켜쥐는 능력을 급격히 감소시킵니다. 이는 트로가 단순히 근처의 어떤 DNA에 걸려 넘어지는 것이 아니라, GPS 유닛이 의도한 표적에 성공적으로 잠금 장치를 걸었을 때만 DNA를 통합하도록 보장합니다.

연구진은 인간 세포에서 이 새로운 시스템을 테스트했습니다. 수정된 단백질 중 하나만 사용했을 때는 아무 일도 일어나지 않았습니다. 하지만 두 버전을 함께 섞었을 때, 트럭이 조립되었고, GPS 유닛이 표적에 잠겼으며, 비특이적 결합 브레이크가 작동했습니다.

결과는 놀라웠습니다. 표적 DNA를 플라스미드(작은 원형 DNA 분자)에 배치한 테스트에서, 새로운 헤테로다이머 시스템은 98.4%의 확률로 올바른 지점에 통합을 유도했습니다. 반면, 수정되지 않은 시스템이나 뒤섞인 GPS 유닛을 가진 시스템은 사용 가능한 모든 곳에 무작위로 통합되었습니다. 또한, 실제 인간 세포(HEK293T)에서 이를 테스트했을 때, DNA가 염색체 6번의 의도된 위치에 정확히 삽입되었음을 확인했습니다. 이 논문은 이 접근 방식이 유전자 치료의 주요 안전 장벽인 "오프 타겟(off-target)" 통합 위험을 해결한다는 점을 시사합니다. 트랜스포사제가 두 개의 서로 다른 표적 도메인이 동시에 결합해야 하는 헤테로다이머로서 작동하도록 강제하고, 무작위로 잡는 것을 억제하기 위해 R336A 돌연변이를 추가함으로써, 이 시스템은 과학자들이 원하는 곳에서만 통합이 일어나도록 보장하며, 이는 이와 같은 유형의 분자 도구로는 이전에 달성하기 어려웠던 수준의 정밀도를 보여줍니다. 저자들은 이것이 중요한 진전이지만, 다양한 세포 유형과 다양한 표적 도메인에서 테스트하기 위해 더 많은 작업이 필요하다고 언급하면서도, 그들이 제공한 구조적 청사진이 더 안전하고 효과적인 유전자 전달 시스템을 설계할 수 있는 명확한 경로를 제시한다고 밝혔습니다.