A cuffed CRISPR guide RNA for microRNA activity-dependent genome editing

कल्पना कीजिए कि आपका शरीर खरबों नन्हे श्रमिकों, जिन्हें कोशिकाएं (cells) कहा जाता है, से बना एक हलचल भरा शहर है। भले ही वे सभी एक ही शरीर में रहते हैं, लेकिन उनके काम बहुत अलग-अलग हैं: कुछ मांसपेशी कोशिकाएं (muscle cells) हैं जो आपको दौड़ने में मदद करती हैं, कुछ यकृत कोशिकाएं (liver cells) हैं जो आपके रक्त को छानती हैं, और कुछ मस्तिष्क कोशिकाएं (brain cells) हैं जो आपको सोचने में मदद करती हैं। एक कोशिका को कैसे पता चलता है कि उसे क्या काम करना है? यह निर्देशों के एक सेट का पालन करती है, लेकिन यह माइक्रोआरएनए (microRNAs या miRNAs) नामक छोटे, फुसफुसाते संदेशों की एक निरंतर धारा को भी सुनती है। miRNAs को शहर के ट्रैफिक कंट्रोलर या रेडियो डीजे के रूप में सोचें। वे सड़कें नहीं बनाते या कारें नहीं चलाते; इसके बजाय, वे विशिष्ट संकेतों को प्रसारित करते हैं जो जीन को "जाओ," "रुको," या "धीमे हो जाओ" कहते हैं। यदि एक यकृत कोशिका "यकृत डीजे" को सुनती है, तो वह जानता है कि विषाक्त पदार्थों को कैसे छाना जाए। यदि एक मांसपेशी कोशिका "मांसपेशी डीजे" को सुनती है, तो वह जानता है कि कैसे संकुचित होना है। वैज्ञानिक लंबे समय से एक ऐसा उपकरण बनाना चाहते थे जो इन विशिष्ट रेडियो संकेतों को सुन सके और, जो कुछ भी वह सुनता है, उसके आधार पर कोशिका के भीतर एक सटीक क्रिया कर सके—जैसे कि कोशिका के व्यवहार को बदलने के लिए एक स्विच पलटना या उसकी स्मृति में एक स्थायी नोट लिखना। चुनौती यह रही है कि वर्तमान उपकरण लाउडस्पीकर की तरह हैं जो सभी के लिए एक संदेश प्रसारित करते हैं, या उन्हें काम करने के लिए जटिल, भारी मशीनरी की आवश्यकता होती है। वे कोशिका के भीतर फिट होने के लिए पर्याप्त छोटे होने और केवल एक विशिष्ट, प्राकृतिक संकेत की उपस्थिति में कार्य करने के लिए पर्याप्त स्मार्ट होने में संघर्ष करते हैं।

यह शोध पत्र एक चतुर नए उपकरण का परिचय देता है जिसे "कफ्ड गाइड आरएनए" (cuffed guide RNA) या cgRNA कहा जाता है, जो एक गुप्त एजेंट की तरह है जो कार्रवाई में जाने के लिए एक विशिष्ट कोड शब्द का इंतजार करता है। शोधकर्ता, एक आणविक मशीन जिसे CRISPR-Cas9 (जिसे अक्सर "आणविक कैंची" कहा जाता है जो डीएनए को काट और संपादित कर सकती है) के साथ काम कर रहे थे, ने उस गाइड का एक विशेष संस्करण डिजाइन किया जो आमतौर पर कैंची को बताती है कि कहाँ काटना है। उन्होंने उस गाइड को लिया और उसे एक गोलाकार आकार में मोड़ा, जैसे कि एक क्लैस्प वाला ब्रेसलेट, जिससे उसके निर्देशों को छिपा दिया गया ताकि वह काम न कर सके। यह "कफ" (cuff) केवल एक विशिष्ट miRNA संकेत द्वारा तोड़ा जाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। जब कोशिका का प्राकृतिक miRNA (ट्रैफिक कंट्रोलर) कफ को पाता है, तो वह लूप को काट देता है, जिससे ब्रेसलेट खुल जाता है। एक बार लूप कट जाने के बाद, गाइड आरएनए एक सीधी रेखा में खुल जाता है, आणविक कैंची को जगा देता है, और उन्हें डीएनए के एक विशिष्ट स्थान पर काटने के लिए कहता है। टीम ने दिखाया कि यह प्रणाली लॉक और की (lock and key) की तरह काम करती है: यदि सही miRNA वहां नहीं है, तो कैंची सोई रहती है। यदि miRNA मौजूद है, तो कैंची जाग जाती है और काम करने लगती है। उन्होंने इसे मानव और चूहे की कोशिकाओं में परीक्षण किया, यह साबित करते हुए कि यह उपकरण कोशिका के अपने प्राकृतिक संकेतों द्वारा चालू और बंद किया जा सकता है। उन्होंने यहाँ तक कि इसका उपयोग यह रिकॉर्ड करने के लिए भी किया कि कोशिका ने समय के साथ किन संकेतों को सुना है, उन यादों को उसके डीएनए कोड में सीधे लिखा। यह सुझाव देता है कि भविष्य में, हम ट्रैक कर सकते हैं कि कोशिकाएं बढ़ते समय कैसे बदलती हैं, या यहां तक कि ऐसी चिकित्सा पद्धतियां डिजाइन कर सकते हैं जो केवल विशिष्ट ऊतकों में सक्रिय होती हैं, जैसे कि एक दवा जो केवल यकृत में काम करती है क्योंकि वह यकृत के अद्वितीय रेडियो सिग्नल को सुनती है।

द सीक्रेट एजेंट गाइड आरएनए

शोधकर्ताओं ने एक समस्या से शुरुआत की: आप एक जीनोम-एडिटिंग टूल कैसे बनाते हैं जो केवल तभी काम करता है जब एक विशिष्ट प्राकृतिक संकेत मौजूद हो? उन्होंने मानक CRISPR प्रणाली को देखा, जो एक लक्ष्य तक Cas9 एंजाइम को ले जाने के लिए एक गाइड आरएनए का उपयोग करती है। उन्होंने महसूस किया कि यदि वे सही क्षण तक गाइड आरएनए के निर्देशों को छिपा सकें, तो वे संपादन (editing) को नियंत्रित कर सकते हैं।

उन्होंने एक "कफ्ड" (cuffed) संस्करण बनाया। कल्पना कीजिए कि एक मानक गाइड आरएनए एक सीधी छड़ी है जो कैंची को लक्ष्य की ओर इशारा करती है। शोधकर्ताओं ने उस छड़ी को लिया, उसे एक घेरे में मोड़ा, और सिरों को एक विशेष लूप के साथ जोड़ दिया। इस लूप में एक विशिष्ट अनुक्रम था जो एक "लक्ष्य" के रूप में कार्य करता है। अपने गोलाकार रूप में, गाइड मुड़ा हुआ और उलझा हुआ होता है, जिससे Cas9 कैंची इसे ठीक से पकड़ नहीं पाती है। यह एक ऐसी चाबी की तरह है जिसे एक वृत्त में मोड़ दिया गया है; यह ताले में फिट नहीं होगी।

जादू तब होता है जब कोशिका का प्राकृतिक माइक्रोआरएनए आता है। माइक्रोआरएनए छोटे अणु होते हैं जो आमतौर पर अन्य आरएनए को खोजने और काटने के लिए होते हैं। शोधकर्ताओं ने अपने कफ्ड गाइड को इस तरह डिजाइन किया कि जब सही माइक्रोआरएनए उसे पाता है, तो वह लूप को काट देता है। यह कट घेरे को तोड़ देता है, जिससे गाइड आरएनए अपनी सीधी, कार्यात्मक आकृति में वापस आ जाता है। अब, यह Cas9 कैंची से जुड़ सकता है और उन्हें डीएनए लक्ष्य की ओर निर्देशित कर सकता है।

लॉक एंड की का परीक्षण

यह देखने के लिए कि क्या यह विचार काम करता है, टीम ने मानव कोशिकाओं (HeLa कोशिकाओं) और चूहे की स्टेम कोशिकाओं में एक परीक्षण प्रणाली बनाई। उन्होंने एक "रिपोर्टर" जीन सेट किया जो केवल तभी हरा चमकता है (EGFP) यदि डीएनए को सही ढंग से संपादित किया गया हो। उन्होंने कफ्ड गाइड आरएनए पेश किया और यह देखने के लिए प्रतीक्षा की कि क्या कोशिकाएं हरी चमकती हैं।

• "ऑफ" स्विच: जब उन्होंने उन कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किए गए कफ्ड गाइड का उपयोग किया जिनमें एक ऐसा माइक्रोआरएनए (miR-122) नहीं था जो उन कोशिकाओं में मौजूद है, तो कोशिकाएं अंधेरी रहीं। गाइड कफ्ड रहा, कैंची सोई रही, और कोई संपादन नहीं हुआ। इसने साबित किया कि सिस्टम गलती से चालू नहीं होता है।
• "ऑन" स्विच: जब उन्होंने कोशिकाओं में लक्षित माइक्रोआरएनए (miR-122) का एक सिंथेटिक संस्करण डाला, तो कोशिकाएं हरी चमकने लगीं। माइक्रोआरएनए ने कफ को काटा, गाइड खुला, और कैंची ने डीएनए को संपादित किया।
• वॉल्यूम कंट्रोल: उन्होंने पाया कि संपादन की मात्रा इस बात पर निर्भर करती थी कि कितना माइक्रोआरएनए मौजूद है। अधिक माइक्रोआरएनए का अर्थ था अधिक कटाई, जिससे पता चला कि सिस्टम सिग्नल की ताकत पर प्रतिक्रिया देता है।

उन्होंने कफ के विभिन्न संस्करणों का भी परीक्षण किया। एक संस्करण (V3) सबसे अच्छा काम करता था, जो एक मजबूत ताले की तरह कार्य करता था जिसे केवल सही चाबी ही खोल सकती थी। उन्होंने यह भी दिखाया कि यह प्रणाली आणविक कैंची के विभिन्न प्रकारों (विभिन्न बैक्टीरिया से Cas9) के साथ काम करती है, जो साबित करता है कि यह एक बहुमुखी उपकरण है।

कफ कैसे काम करता है (जादू के पीछे का विज्ञान)

यह समझने के लिए कि कफ वास्तव में कैंची को क्यों रोकता है, शोधकर्ताओं ने शक्तिशाली सूक्ष्मदर्शी (क्रायो-ईएम) का उपयोग करके Cas9 एंजाइम के बगल में बैठे कफ्ड गाइड आरएनए की 3D तस्वीरें लीं। उन्होंने पाया कि कफ तीन कारणों से कैंची को निष्क्रिय रखता है:

1. पकड़ना कठिन है: गोलाकार आकार Cas9 एंजाइम के लिए गाइड आरएनए को पकड़ना मुश्किल बना देता है।
2. लक्ष्य ढूंढना कठिन है: भले ही Cas9 गाइड को पकड़ ले, गोलाकार आकार गाइड को डीएनए लक्ष्य खोजने से रोकता है। यह एक नक्शे को पढ़ने की कोशिश करने जैसा है जबकि वह कसकर रोल किया हुआ है।
3. गलत स्थिति में फंसा हुआ: उन दुर्लभ मामलों में जहां गाइड डीएनए को ढूंढ लेता है, गोलाकार आकार कैंची को एक ऐसी घुमावदार स्थिति में धकेलता है जहां वे काट नहीं सकते। एंजाइम का "कैंची" वाला हिस्सा भौतिक रूप रूप से डीएनए से दूर धकेल दिया जाता है, जैसे कि कैंची के हैंडल मुड़े हुए हों जिससे आप उन्हें एक साथ नहीं दबा सकते।

एक बार जब माइक्रोआरएनए लूप को काट देता है, तो ये सभी समस्याएं समाप्त हो जाती हैं। गाइड सीधा हो जाता है, Cas9 उसे आसानी से पकड़ लेता है, डीएनए को ढूंढता है, और सटीकता के साथ काटता है।

अतीत को रिकॉर्ड करना: एक कोशिकीय डायरी

टीम द्वारा प्रदर्शित सबसे शानदार अनुप्रयोगों में से एक इस प्रणाली का उपयोग "आणविक डायरी" के रूप में करना है। चूंकि संपादन स्थायी है, इसलिए एक बार जब कोशिका एक संकेत सुनती है और कैंची डीएनए को काट देती है, तो वह परिवर्तन हमेशा के लिए वहां रहता है।

उन्होंने दिखाया कि वे समय के साथ माइक्रोआरएनए की गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, उन्होंने चूहे की स्टेम कोशिकाओं को चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (smooth muscle cells) में बदलते हुए देखा। जैसे-जैसे कोशिकाएं बदलीं, विभिन्न माइक्रोआरएनए चालू और बंद हुए। कफ्ड गाइड्स ने अलग-अलग समय पर डीएनए को काटकर इन परिवर्तनों को रिकॉर्ड किया। बाद में डीएनए को देखकर, वे बता सकते थे कि कोशिका ने कौन से संकेत सुने थे और कब।

उन्होंने इसे और आगे बढ़ाया ताकि नियमित जीन की अभिव्यक्ति को रिकॉर्ड किया जा सके। उन्होंने एक ऐसी प्रणाली विकसित की जहाँ एक जीन (जैसे Nanog, जो स्टेम कोशिकाओं में सक्रिय है लेकिन मांसपेशी कोशिकाओं में नहीं) सक्रिय होने पर एक सिंथेटिक माइक्रोआरएनए उत्पन्न करेगा। यह सिंथेटिक माइक्रोआरएनए फिर कफ्ड गाइड को काटेगा, जिससे जीन की गतिविधि को रिकॉर्ड किया जाएगा।

• स्टेम कोशिकाओं में, Nanog जीन सक्रिय था, इसलिए सिंथेटिक माइक्रोआरएनए बनाया गया, कफ काटा गया, और डीएनए को संपादित किया गया।
• मांसपेशी कोशिकाओं में, Nanog बंद था, इसलिए कोई माइक्रोआरएनए नहीं बना, और डीएनए अप्रतिबंधित (unedited) रहा।

इसका अर्थ है कि वे कोशिका के डीएनए को देखकर यह बता सकते हैं कि कोशिका क्या कर रही थी, भले ही मूल संकेत (जीन गतिविधि) लंबे समय पहले समाप्त हो गया हो।

भविष्य के लिए इसका क्या अर्थ है

शोध पत्र सुझाव देता है कि यह "कफ्ड गाइड आरएनए" जैविक संकेतों को स्थायी डीएनए परिवर्तनों में बदलने का एक सरल, मजबूत तरीका है। यह केवल एक प्रयोगशाला का प्रयोग नहीं है; शोधकर्ताओं ने दिखाया कि यह जीवित चूहों में भी काम करता है। उन्होंने चूहे के भ्रूणों में इस प्रणाली को इंजेक्ट किया, और परिणामी चूहों में संपादन केवल उनके यकृत (जहाँ विशिष्ट माइक्रोआरएनए पाया जाता है) में हुआ और उनके हृदय में नहीं हुआ। यह एक ऐसे भविष्य की ओर संकेत करता जहाँ हम ऐसी चिकित्सा पद्धतियां डिजाइन कर सकते हैं जो केवल विशिष्ट अंगों में सक्रिय होती हैं, जिससे दुष्प्रभाव कम होते हैं।

लेखकों का सुझाव है कि यह उपकरण वैज्ञानिकों को यह मैप करने में मदद कर सकता है कि कोशिकाएं बढ़ते समय कैसे बदलती हैं, बीमारियों के इतिहास को ट्रैक कर सकता है, या जटिल जेनेटिक सर्किट बना सकता है जो कोशिका के वातावरण के आधार पर निर्णय लेते हैं। यह कोशिका की अपनी प्राकृतिक भाषा (माइक्रोआरएनए) को उसकी अपनी कहानी को फिर से लिखने के निर्देशों के सेट में बदल देता है। हालांकि इस तकनीक को अभी भी परिष्कृत किया जा रहा है, यह शोध पत्र दिखाता है कि हम कोशिकाओं को सुनने और उन्हें अपनी यादें लिखने में सक्षम बनाने की दुनिया के करीब पहुंच रहे हैं।