High-performance xenograft read-sorting for DNA methylation analysis

कैंसर अनुसंधान की दुनिया में, वैज्ञानिकों को अक्सर मानव शरीर की नकल करने वाले जीवित वातावरण में ट्यूमर का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है। ऐसा करने के लिए, वे मानव कैंसर कोशिकाओं को चूहों में प्रत्यारोपित करते हैं, जिससे 'पेशेंट-डिराइव्ड जेनोक्राफ्ट' (patient-derived xenografts) बनते हैं। ये छोटे जीवित प्रयोगशालाएं शोधकर्ताओं को यह देखने की अनुमति देती हैं कि एक ट्यूमर कैसे बढ़ता है, दवाओं के प्रति कैसी प्रतिक्रिया देता है, और वह उपचार के प्रति कैसे प्रतिरोधी हो सकता है। हालाँकि, जब वैज्ञानिक इन मिश्रित नमूनों से आनुवंशिक सामग्री का विश्लेषण करने की कोशिश करते हैं, तो एक बड़ी बाधा आती है। अंतिम उत्पाद डीएनए (DNA) स्ट्रैंड्स का एक अराजक मिश्रण होता है, जिनमें से कुछ मानव ट्यूमर के होते हैं और अन्य चूहे के मेजबान (host) के। ट्यूमर के व्यवहार को समझने के लिए, शोधकर्ताओं को मानव स्ट्रैंड्स को चूहे के स्ट्रैंड्स से अत्यधिक सटीकता के साथ अलग करना होगा। डीएनए मिथाइलेशन (DNA methylation) का अध्ययन करते समय यह कार्य और भी कठिन हो जाता है, जो एक रासायनिक टैग है जो जीन को चालू या बंद करने वाले स्विच की तरह कार्य करता है। इन टैगों को पढ़ने के लिए, वैज्ञानिक एक ऐसी रासायनिक प्रक्रिया का उपयोग करते हैं जो डीएनए अनुक्रम को ही बदल देती है, जिससे अक्षर इस तरह से गड़बड़ा जाते हैं जो जेनेटिक डेटा को छांटने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक कंप्यूटर प्रोग्रामों को भ्रमित कर देते हैं।

शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस जटिल आनुवंशिक उलझन को सुलझाने का एक स्मार्ट तरीका विकसित किया है, विशेष रूप से इन रासायनिक रूप से परिवर्तित डीएनए नमूनों के लिए। उन्होंने एक मौजूदा सॉफ्टवेयर टूल 'ज़ेनसॉर्ट' (Xengsort) को उन्नत किया, जिससे यह एक अत्यधिक कुशल सॉर्टर बन गया जो रासायनिक परिवर्तनों के बाद भी मानव और चूहे के डीएनए के बीच अंतर कर सकता है। टीम ने कंप्यूटर द्वारा निर्मित मिश्रणों और स्तन कैंसर के वास्तविक डेटा का उपयोग करके अपने बेहतर टूल का अन्य स्थापित तरीकों के विरुद्ध परीक्षण किया। उन्होंने पाया कि हालांकि सभी उपकरण डीएनए के स्रोत की पहचान करने में आम तौर पर सटीक थे, लेकिन ज़ेनसॉर्ट का नया संस्करण नाटकीय रूप से तेज़ था और इसे बहुत कम कंप्यूटर मेमोरी की आवश्यकता थी। वास्तविक रोगी नमूनों वाले एक बड़े पैमाने के परीक्षण में, नए टूल ने सॉर्टिंग का काम केवल पांच घंटों से कुछ अधिक समय में पूरा किया, जबकि एक प्रतिस्पर्धी विधि को उसी कार्य को पूरा करने में लगभग तीस घंटे लगे।

समस्या का मूल डीएनए मिथाइलेशन को पढ़ने के तरीके में निहित है। रासायनिक स्विचों को देखने के लिए, वैज्ञानिक डीएनए को एक ऐसे पदार्थ से उपचारित करते हैं जो एक विशिष्ट अक्षर, साइटोसिन (cytosine) को दूसरे, थाइमिन (thymine) में बदल देता है, यदि वह अक्षर रासायनिक रूप से टैग नहीं किया गया है। ट्यूमर कैसे अनुकूलित होते हैं, इसे समझने के लिए यह प्रक्रिया आवश्यक है, लेकिन यह मौलिक रूप से डीएनए अनुक्रम को बदल देती है। कल्पना कीजिए कि आप मिश्रित किताबों के ढेर को छाँटने की कोशिश कर रहे हैं जहाँ किसी ने आधी किताबों में हर शब्द की स्पेलिंग बदल दी है; एक मानक लाइब्रेरियन को यह बताने में संघर्ष करना पड़ेगा कि कौन सी किताब किस लेखक की है। इसी तरह, मानक कंप्यूटर प्रोग्राम जो डीएनए अनुक्रमों को संदर्भ जीनोम (reference genome) से मिलाते हैं, अक्सर विफल हो जाते हैं क्योंकि रासायनिक परिवर्तन मानव डीएनए को मानव संदर्भ से अलग और चूहे के डीएनए को चूहे के संदर्भ से अलग बना देते हैं। यह भ्रम इस ओर ले जा सकता है कि मानव ट्यूमर स्ट्रैंड्स को चूहे के स्ट्रैंड्स के रूप में गलत पहचाना जाए, या इसके विपरीत, जो वैज्ञानिक विश्लेषण को खराब कर देगा।

इसे हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने ज़ेनसॉर्ट टूल के आंतरिक शब्दकोश (dictionary) को फिर से बनाया। केवल डीएनए अक्षरों के सटीक मिलान की तलाश करने के बजाय, नया टूल रासायनिक परिवर्तनों का पूर्वानुमान लगाता है। यह एक दोहरा-स्तरीय इंडेक्स (dual-layered index) बनाता है जो मूल डीएनए अनुक्रम और रासायनिक रूपांतरण के बाद के अनुक्रम दोनों को ध्यान में रखता है। जब डीएनए का एक टुकड़ा सिस्टम में प्रवेश करता है, तो टूल दोनों संभावनाओं की एक साथ जांच करता है। यह डीएनए स्ट्रैंड को छोटे टुकड़ों में तोड़ता है और एक सरल प्रश्न पूछता है: क्या यह टुकड़ा रासायनिक परिवर्तनों को ध्यान में रखते हुए मानव या चूहे का लगता है? डीएनए के सबसे अनूठे टुकड़ों पर भरोसा करके और उन टुकड़ों को अनदेखा करके जो दोनों प्रजातियों में बहुत समान दिखते हैं, टूल आत्मविश्वास के साथ स्ट्रैंड्स को मानव, चूहे, या संदिग्ध श्रेणियों में छाँट सकता है। यह दृष्टिकोण सॉफ्टवेयर को प्रत्येक स्ट्रैंड को पूर्ण जीनोम के साथ संरेखित (align) करने की धीमी, भारी प्रक्रिया को छोड़ने की अनुमति देता है, जो कि अन्य तरीकों की आवश्यकता होती है।

शोधकर्ताओं ने अपने टूल का दो तरह से परीक्षण किया। पहले, उन्होंने मानव और चूहे के डीएनए स्ट्रैंड्स के लाखों सिम्युलेटेड मिश्रण बनाए, जिससे वे यह सटीक रूप से माप सके कि टूल कितनी बार गलतियाँ करता है। उन्होंने इन मिश्रणों का विभिन्न गहराई और अनुपात पर परीक्षण किया, जिसमें बहुत कम मानव डीएनए वाले नमूने से लेकर लगभग पूरी तरह से मानव डीएनए वाले नमूने तक सब कुछ शामिल था। परिणाम दर्शाते हैं कि टूल अविश्वसनीय रूप से सटीक था, जिसमें बहुत कम मानव स्ट्रैंड्स खो गए और चूहे के स्ट्रैंड्स को मानव के रूप में पहचानने की बहुत कम गलतियाँ हुईं। यह सटीकता के मामले में अन्य शीर्ष उपकरणों के समान ही प्रदर्शन करता था, लेकिन इसने यह काम बहुत कम समय में किया। जहाँ अन्य तरीकों को डेटा को प्रोसेस करने में घंटों लग गए और उन्हें भारी मात्रा में कंप्यूटर मेमोरी की आवश्यकता थी, वहीं ज़ेनसॉर्ट ने एक मानक कंप्यूटर सेटअप पर एक घंटे से भी कम समय में वही काम पूरा कर लिया।

इसके बाद, टीम ने वास्तविक डेटा पर अपने टूल को लागू किया जो स्तन कैंसर के रोगियों से प्राप्त था जिनके ट्यूमर चूहों में उगाए गए थे। ये नमूने विभिन्न प्रकार के अध्ययनों से आए थे, जिनमें से कुछ जहाँ डीएनए को रासायनिक रूप से परिवर्तित किया गया था और अन्य जहाँ इसे एंजाइमों का उपयोग करके संसाधित किया गया था। इन वास्तविक दुनिया के परिदृश्यों में, टूल ने फिर से अपनी उपयोगिता सिद्ध की। इसने जटिल नमूनों से डीएनए को सफलतापूर्वक छाँटा, जिसमें बहुत कम मात्रा में मानव ट्यूमर कोशिकाएं और बहुत अधिक मात्रा में चूहे के ऊतक (tissue) शामिल थे। शोधकर्ताओं ने नोट किया कि टूल विशेष रूप से उन नम들이 के साथ मजबूत था जिन्हें डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न को बदलने के लिए दवाओं से उपचारित किया गया था। गति और संसाधन उपयोग के प्रत्यक्ष तुलना में, नया टूल काफी अधिक कुशल था। इसने 43 गीगाबाइट मेमोरी का उपयोग करके 5.5 घंटों में एक बड़ा डेटासेट प्रोसेस किया, जबकि एक प्रतिस्पर्धी विधि को 29.1 घंटे लगे और 49 गीगाबाइट मेमोरी की आवश्यकता थी। एक अन्य विधि, जो एक संयुक्त संदर्भ जीनोम पर निर्भर थी, तेज़ थी लेकिन उसे भारी 73 गीगाबाइट मेमोरी की आवश्यकता थी, जो कई प्रयोगशालाओं के लिए एक सीमित कारक हो सकता है।

अध्ययन ने यह भी रेखांकित किया कि सटीकता के लिए छांटने के तरीके का चुनाव दक्षता की तुलना में कम महत्वपूर्ण है। सभी परीक्षण किए गए उपकरणों, जिसमें नया ज़ेनसॉर्ट भी शामिल है, ने डीएनए स्ट्रैंड्स को अलग करने में उच्च सटीकता प्राप्त की। हालाँकि, उन परिणामों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय और कंप्यूटिंग शक्ति में बहुत अंतर था। जो शोधकर्ता बड़े डेटासेट पर काम कर रहे हैं या जिन्हें उपचार के निर्णय लेने के लिए तेजी से नमूनों को प्रोसेस करने की आवश्यकता है, उनके लिए ज़ेनसॉर्ट की गति और कम मेमोरी फुटप्रिंट एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है। शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि उनका वर्कफ़्लो अब व्यापक उपयोग के लिए तैयार है, और वे सुझाव देते हैं कि वैज्ञानिकों को विस्तृत विश्लेषण से पहले इस टूल का उपयोग करके अपने डीएनए स्ट्रैंड्स को प्रजातियों के आधार पर छाँटना चाहिए। छंटाई के चरण को तेज़ और कम संसाधन-गहन बनाकर, यह टूल एक प्रमुख बाधा (bottleneck) को दूर करता है, जिससे वैज्ञानिक ट्यूमर को समझने पर अधिक समय केंद्रित कर सकते हैं बजाय इसके कि वे कंप्यूटर के काम पूरा करने का इंतज़ार करें।