DIPLER: rapid k-mer-based locus identification
यह शोध पत्र Dipler को प्रस्तुत करता है, जो एक तीव्र, संदर्भ-स्वतंत्र दो-चरणीय विधि है जो समूह-विशिष्ट k-mer पहचान को लक्षित PacBio de novo असेंबली के साथ जोड़कर कम अनुक्रमण कवरेज (sequencing coverage) पर यूकेरियोटिक जीनोम में संरचनात्मक रूप से जटिल, विचलित एलील्स (alleles) को सफलतापूर्वक हल और असेंबल करता है।
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जीनोम जीवन के निर्देश मैनुअल हैं, जो चार रासायनिक अक्षरों के एक कोड में लिखे गए हैं जो यह बताते हैं कि एक जीव कैसे बढ़ता और कार्य करता है। दशकों से, वैज्ञानिक इन मैनुअल्स को एक एकल, पूर्ण संदर्भ प्रति (reference copy) से तुलना करके पढ़ने का प्रयास कर रहे हैं, ठीक वैसे ही जैसे किसी नए मानचित्र की तुलना एक विश्वसनीय एटलस से करना। यह दृष्टिकोण तब अच्छा काम करता है जब भूभाग परिचित हो, लेकिन जब परिदृश्य जंगली, उलझा हुआ या एटलस से पूरी तरह गायब हो, तो यह संघर्ष करता है। कई महत्वपूर्ण आनुवंशिक अंतर, जैसे कि वे जो यह निर्धारित करते हैं कि एक पेड़ जल्दी फूल देता है या देर से, जटिल, दोहराव वाले क्षेत्रों में मौजूद होते हैं जिन्हें मानक मानचित्र अक्सर छोड़ देते हैं या गलत समझते हैं। इन छिपे हुए निर्देशों को खोजने के लिए, शोधकर्ताओं ने कच्चे आनुवंशिक डेटा के भीतर ही छोटे, अद्वितीय पैटर्न खोजने की दिशा में कदम बढ़ाया है, बजाय इसके कि डेटा को किसी पूर्व-मौजूद टेम्पलेट में फिट करने के लिए मजबूर किया जाए। यह बदलाव उन्हें उन विशिष्ट आनुवंशिक हस्ताक्षरों को पहचानने की अनुमति देता है जो जीवों के एक समूह को दूसरे से अलग करते हैं, भले ही उनके डीएनए की समग्र संरचना नेविगेट करने में कठिन क्यों न हो।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस चुनौती से निपटने के लिए 'डिप्लर' (Dipler) नामक एक नई विधि विकसित की है, जो इन जटिल आनुवंशिक क्षेत्रों को खोजने का एक तेज़ और अधिक सीधा तरीका प्रदान करती है। टीम ने अपने दृष्टिकोण का परीक्षण अखरोट के पेड़ों पर किया, विशेष रूप से एक जीन पर जो फूलों के प्रकट होने के क्रम को नियंत्रित करता है। कुछ पेड़ों में, नर फूल पहले खिलते हैं, जबकि अन्य में, मादा फूल पहले खिलते हैं। यह अंतर डीएनए के एक विशिष्ट हिस्से के कारण होता है जो दोनों प्रकारों के बीच काफी भिन्न होता है: एक संस्करण में जीन एक सरल, एकल प्रति है, जबकि दूसरे में एक जटिल, दोहराव वाली संरचना है जो खुद को कई बार दोहराती है। क्योंकि यह दोहराव वाला हिस्सा मानक संस्करण से इतना अलग है, इसलिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके इसे सही ढंग से असेंबल करना अत्यंत कठिन होता है। शोधकर्ता यह देखना चाहते थे कि क्या वे एक संदर्भ जीनोम पर मार्गदर्शन के लिए निर्भर किए बिना इस विशिष्ट, जटिल डीएनए के टुकड़े को अलग और पुनर्गठित कर सकते हैं।
प्रक्रिया की शुरुआत दो समूहों के अखरोट के पेड़ों के आनुवंशिक डेटा की तुलना करके हुई: वे जिनमें जटिल, दोहराव वाला जीन था और वे जिनमें सरल, एकल-प्रति संस्करण था। शोधकर्ताओं ने डेटा को छोटे, अद्वितीय अनुक्रमों के लिए स्कैन किया, जिन्हें 'के-मर्स' (k-mers) कहा जाता है, जो जटिल समूह में बार-बार दिखाई देते थे लेकिन सरल समूह में अनुपस्थित थे। उन्होंने पाया कि अपने तुलना में अधिक संख्या में पेड़ों का उपयोग करके, वे यादृच्छिक शोर (noise) को फ़िल्टर कर सकते थे और इन अद्वितीय अनुक्रमों का एक सटीक सेट पहचान सकते थे जो जटिल जीन के लिए एक फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य करते थे। एक बार जब उनके पास यह फिंगरप्रिंट आ गया, तो उन्होंने इसे 'लॉन्ग-रीड सीक्वेंसिंग' डेटा के माध्यम से छानने के लिए उपयोग किया, जो मानक तरीकों की तुलना में डीएनए के बहुत लंबे हिस्सों को कैप्चर करता है। उन्होंने केवल उन्हीं लंबी स्ट्रैंड्स को चुना जिनमें ये अद्वितीय फिंगरप्रिंट मौजूद थे, जिससे प्रभावी रूप से शेष जीनोम को फ़िल्टर कर दिया गया।
इन फ़िल्टर किए गए डीएनए स्ट्रैंड्स के साथ, शोधकर्ताओं ने शून्य से जटिल जीन के पूर्ण अनुक्रम को जोड़ा। अपने पहले परीक्षण में, एक ऐसे पेड़ का उपयोग करते हुए जिसमें एक जटिल जीन की एक प्रति और एक सरल जीन की एक प्रति थी, उन्होंने नौ गुना जीनोम कवरेज के बराबर डेटा का उपयोग करके जटिल संस्करण को सफलतापूर्वक पुनर्गठित किया। यह एक महत्वपूर्ण उपलब्धि थी क्योंकि इसने दिखाया कि भले ही लक्षित जीन आनुवंशिक सामग्री के केवल आधे हिस्से में मौजूद हो, फिर भी यह विधि उसे खोज और बना सकती है। अपनी सीमाओं को और आगे बढ़ाने के लिए, उन्होंने इसी तकनीक को एक अलग अखरोट की किस्म पर लागू किया जिसमें जटिल जीन की दो प्रतियां थीं, लेकिन उनके बीच थोड़े अंतर थे। यह एक कठिन कार्य था, क्योंकि विधि को दो बहुत समान, फिर भी अलग संस्करणों के बीच अंतर करना था। उन्होंने पाया कि उन्हें दोनों संस्करणों को स्वतंत्र रूप से अलग करने और असेंबल करने के लिए तेरह गुना जीनोम कवरेज के बराबर डेटा की आवश्यकता थी।
परिणाम दर्शाते हैं कि यह नया वर्कफ़्लो बिना किसी संदर्भ मानचित्र की आवश्यकता के तेजी से जटिल आनुवंशिक लोकी (loci) की पहचान और पुनर्गठन कर सकता है। शोधकर्ताओं ने दिखाया कि यह विधि पहले उन अद्वितीय आनुवंशिक मार्करों की पहचान करके, जो एक लक्षण को परिभाषित करते हैं, फिर उन मार्करों का उपयोग करके एक बड़े डेटासेट से प्रासंगिक डीएनए स्ट्रैंड्स को निकालकर, और अंत में उन स्ट्रैंड्स को एक पूर्ण अनुक्रम में असेंबल करके काम करती है। उन्होंने उल्लेख किया कि आवश्यक डेटा की मात्रा कार्य की जटिलता पर निर्भर करती; एक संस्करण के जीनोम से काफी हद तक गायब जीन को खोजने के लिए, एक ही जीन के दो बहुत समान संस्करणों को अलग करने की तुलना में कम डेटा की आवश्यकता थी। हालांकि इन विशिष्ट अखरोट प्रयोगों में नौ और तेरह गुना कवरेज के संख्यात्मक मान देखे गए, लेकिन अंतर्निहित रणनीति एक लचीला ढांचा प्रदान करती है जिसे अन्य प्रजातियों और जटिल आनुवंशिक लक्षणों पर लागू किया जा सकता है। यह कार्य सुझाव देता है कि समूहों को अलग करने वाले अद्वितीय पैटर्न पर ध्यान केंद्रित करके, वैज्ञानिक संदर्भ जीनोम की सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं और सीधे कोड के सबसे कठिन हिस्सों तक पहुँच सकते हैं।
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