Rapid and sensitive qPCR-based quantification of Salmonella Gallinarum Bacteriophages cocktail (SAL3)

बैक्टीरिया के खिलाफ चल रही लड़ाई में, जो अब मानक दवाओं के प्रति प्रतिक्रिया नहीं देते हैं, वैज्ञानिक प्रकृति के अपने शिकारियों की ओर मुड़ रहे हैं: वे वायरस जो केवल बैक्टीरिया को संक्रमित करते हैं। ये वायरस, जिन्हें बैक्टीरियोफेज (bacteriophages) कहा जाता है, सूक्ष्म शिकारी की तरह काम करते हैं जो विशिष्ट बैक्टीरिया के उपभेदों (strains) को खोजते हैं, उन पर आक्रमण करते हैं, और उन्हें भीतर से नष्ट कर देते हैं। क्योंकि वे बहुत सटीक हैं, वे व्यापक-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स के लिए एक आशाजनक विकल्प प्रदान करते हैं, जो बुरे सूक्ष्मजीवों के साथ-साथ लाभकारी सूक्ष्मजीवों को भी नुकसान पहुँचा सकते हैं। यह दृष्टिकोण पोल्ट्री फार्मिंग (मुर्गपालन) में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहाँ 'साल्मोनेला गैलिनारम' (Salmonella Gallinarum) नामक बैक्टीरिया का एक विशिष्ट प्रकार 'फाउल टाइफाइड' (fowl typhoid) नामक गंभीर बीमारी का कारण बनता है। इन वायरल शिकारियों का प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए, किसानों और शोधकर्ताओं को उन्हें एक "कॉकटेल" में मिलाने की आवश्यकता होती है, जो कि एक ऐसा घोल है जिसमें कई अलग-अलग प्रकार के फेजेस मिलकर काम करते हैं। हालाँकि, एक बड़ी बाधा हमेशा यह रही है कि मिश्रण में प्रत्येक वायरस की सटीक संख्या कितनी है। यदि संतुलन गलत हुआ, तो उपचार विफल हो सकता है।

पारंपरिक रूप से, वैज्ञानिक इन वायरसों को गिनने के लिए एक ऐसी विधि का उपयोग करते हैं जिसमें पेट्री डिश में बैक्टीरिया की एक परत पर उन्हें उगाना शामिल है। वे वायरसों के बैक्टीरिया को मारने और स्पष्ट, गोलाकार धब्बे बनाने का इंतजार करते हैं जिन्हें 'प्लाक' (plaques) कहा जाता है। जबकि यह विधि विश्वसनीय है, यह धीमी है, परिणाम देने में आधे दिन से अधिक समय लेती है, और जब कई प्रकार के वायरस मिले हुए होते हैं तो यह संघर्ष करती है क्योंकि उनके धब्बे अक्सर एक जैसे दिखते हैं। पाकिस्तान के पंजाब विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस समस्या को हल करने का एक बहुत तेज़ तरीका विकसित किया है। उन्होंने एक आणविक परीक्षण (molecular test) बनाया जो कुछ ही घंटों में एक ही मिश्रण में तीन विशिष्ट वायरसों की पहचान और गणना कर सकता है, जो इन जीवन रक्षक उपचारों को तैयार करने के लिए गति और सटीकता का एक नया स्तर प्रदान करता है।

शोधकर्ताओं ने एक विशिष्ट कॉकटेल पर ध्यान केंद्रित किया जिसे SAL3 कहा जाता है, जिसमें तीन अलग-अलग वायरस शामिल हैं जिन्हें 'साल्मोनेला गैलिनारम' का शिकार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इन वायरसों को, जिनका नाम SGP9, SGP13 और फ्रैंक (Frank) है, अलग किया गया और लैब में उगाया गया। चुनौती यह थी कि बिना बैक्टीरिया को डिश में मारने का इंतजार किए यह पता लगाया जाए कि प्रत्येक वायरस की कितनी संख्या मौजूद है। वायरसों के अपना काम करने का इंतजार करने के बजाय, टीम ने सीधे उनके भीतर मौजूद आनुवंशिक सामग्री (genetic material) को देखा। उन्होंने छोटे आणविक प्रोब (molecular probes) डिजाइन किए, जो अत्यधिक विशिष्ट सर्चलाइट की तरह कार्य करते हैं, जो प्रत्येक वायरस के अद्वितीय डीएनए अनुक्रम (DNA sequence) को खोजकर उससे जुड़ सकते हैं। जब इन प्रोब्स ने अपने लक्ष्य को पाया, तो उन्होंने एक संकेत उत्सर्जित किया जिसे एक मशीन द्वारा मापा जा सकता था, जिससे शोधकर्ता मौजूद आनुवंशिक सामग्री की मात्रा के आधार पर वायरसों की गिनती कर सके।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि उनकी नई विधि सटीक है, टीम ने पहले एक संदर्भ प्रणाली (reference system) बनाई। उन्होंने वायरल डीएनए के छोटे टुकड़ों को लिया और उन्हें प्लाज्मिड (plasmids) नामक गोलाकार डीएनए अणुओं में डाला। इन प्लाज्मिड्स की ज्ञात मात्रा वाले समाधानों की एक श्रृंखला बनाकर, वे एक ऐसा मानचित्र बना सके जो मशीन के संकेत की शक्ति को वायरल जीनोम की सटीक संख्या से जोड़ता है। इस अंशांकन (calibration) ने उन्हें अपने नमूनों से प्राप्त संकेतों को सटीक गणनाओं में अनुवादित करने में सक्षम बनाया। उन्होंने इस प्रणाली का परीक्षण व्यक्तिगत रूप से इन तीन वायरसों पर किया और पाया कि यह एक एकल प्रतिक्रिया में मात्र दो से बीस वायरल जीनोम तक का पता लगा सकता है, जो संवेदनशीलता का एक ऐसा स्तर है जो पारंपरिक डिश विधि की तुलना में कहीं अधिक है।

जब शोधकर्ताओं ने अपने नए तीव्र परीक्षण की पुराने डिश विधि के साथ तुलना की, तो उन्होंने एक सुसंगत पैटर्न पाया। नया परीक्षण लगातार डिश विधि की तुलना में वायरसों की उच्च संख्या रिपोर्ट करता है। यह अंतर कोई त्रुटि नहीं है बल्कि वास्तव में प्रत्येक विधि द्वारा गिनी जाने वाली चीज़ का प्रतिबिंब है। डिश विधि केवल उन वायरसों को गिनती है जो पूरी तरह जीवित हैं और एक बैक्टीरिया को संक्रमित करने या प्लाक बनाने में सक्षम हैं। हालाँकि, नया परीक्षण प्रत्येक उस वायरस कण को गिनता है जिसकी आनुवंशिक सामग्री बरकरार है, जिसमें वे भी शामिल हैं जो क्षतिग्रस्त हो सकते हैं या मेजबान को संक्रमित करने में असमर्थ हैं। शोधकर्ताओं ने पाया कि प्रत्येक विशिष्ट वायरस के लिए, नए परीक्षण और पुरानी विधि के बीच का अनुपात स्थिर था। उदाहरण के लिए, नए परीक्षण ने SGP13 वायरसों की संख्या डिश विधि की तुलना में लगभग सात गुना अधिक पाई, जबकि फ्रैंक वायरस के लिए, अनुपात छह से एक के आसपास था। यह निरंतरता दर्शाती है कि भले ही संख्याएँ भिन्न हों, नया परीक्षण एक बैच में कुल वायरल कणों की संख्या का अनुमान लगाने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है।

अपने नए तरीके को पारंपरिक विधि के अधिक करीब लाने के लिए, टीम ने अपनी प्रक्रिया में एक चरण जोड़ा। उन्होंने वायरस के मिश्रण को एक एंजाइम के साथ उपचारित किया जो कैंची की तरह काम करता है और घोल में तैर रहे किसी भी ढीले डीएनए को काट देता है। यह एंजाइम एक स्वस्थ वायरस के कठोर बाहरी कवच को नहीं भेद सकता, इसलिए यह स्वस्थ वायरस के भीतर की आनुवंशिक सामग्री को वैसे ही छोड़ देता है। इस उपचार के बाद, नया परीक्षण केवल उन वायरसों को गिनता है जो उनके कवच द्वारा पूरी तरह सुरक्षित हैं। उपचारित नमूने से प्राप्त परिणाम पारंपरिक डिश विधि के गणनाओं के साथ बहुत करीब से मेल खाते हैं, जो पुष्टि करता है कि यदि नमूने को सही ढंग से तैयार किया जाए, तो नया परीक्षण वास्तव में संक्रामक वायरसों की संख्या को सटीक रूप से माप सकता है।

इस नए दृष्टिकोण की वास्तविक शक्ति तब प्रदर्शित हुई जब शोधकर्ताओं ने अंतिम SAL3 कॉकटेल बनाने के लिए तीनों वायरसों को एक साथ मिलाया। अतीत में, डिश विधि का उपयोग करके ऐसे मिश्रण में विभिन्न वायरसों के बीच अंतर करना लगभग असंभव होता, क्योंकि उनके प्लाक एक जैसे दिखते थे। मल्टीप्लेक्सिंग (multiplexing) नामक तकनीक का उपयोग करते हुए, टीम ने एक साथ अपने तीनों विशिष्ट प्रोब्स के साथ परीक्षण चलाया। मशीन तुरंत वायरसों के बीच अंतर कर सकती थी क्योंकि प्रत्येक प्रोब को एक अलग रंग के संकेत के साथ टैग किया गया था। परिणामों ने दिखाया कि परीक्षण ने मिश्रण में प्रत्येक वायरस की मात्रा को सटीक रूप से मापा, जो इस आधार पर मेल खाता था कि उनमें से प्रत्येक को कितनी मात्रा में जोड़ा गया था। इसने सिद्ध किया कि यह विधि जटिल मिश्रणों को बिना वायरसों को भ्रमित किए संभाल सकती है।

इस नई विधि के लाभ केवल इसकी सटीकता तक ही सीमित नहीं हैं। पूरी प्रक्रिया शुरू से अंत तक तीन घंटे से भी कम समय लेती है, जबकि पारंपरिक डिश विधि के लिए बारह घंटे या उससे अधिक समय की आवश्यकता होती है। यह गति उत्पादन में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि वायरल कॉकटेल का प्रत्येक बैच उपयोग किए जाने से पहले सुसंगत है। शोधकर्ताओं ने यह भी पाया कि उनकी नई विधि अत्यधिक पुनरुत्पादनीय (reproducible) थी, जिसका अर्थ है कि यदि वे एक ही नमूने को कई बार चलाते हैं, तो उन्हें हर बार लगभग समान परिणाम मिलते हैं। यह विश्वसनीयता उन उपचारों को विकसित करने के लिए आवश्यक है जिन पर डॉक्टर और किसान भरोसा कर सकें।

गति, संवेदनशीलता और एक ही मिश्रण में विभिन्न वायरसों के बीच अंतर करने की क्षमता को जोड़कर, यह अध्ययन फेज थेरेपी (phage therapy) के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह सुनिश्चित करने का एक तरीका प्रदान करता है कि बैक्टीरिया के संक्रमण से लड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरल कॉ коктейल संतुलित हैं, जिससे प्रतिरोधी बैक्टीरिया के विरुद्ध उनकी प्रभावशीलता अधिकतम हो सके। जबकि पारंपरिक विधि यह पुष्टि करने के लिए उपयोगी बनी हुई है कि वायरस वास्तव में बैक्टीरिया को संक्रमित कर सकते हैं, यह नया आणविक दृष्टिकोण एक महत्वपूर्ण अंतर को भरता है क्योंकि यह वैज्ञानिकों को तेजी से और स्पष्ट रूप से यह देखने की अनुमति देता है कि उनके घोल में वास्तव में क्या है। जैसे-जैसे दुनिया एंटीबायोटिक्स के विकल्पों की तलाश कर रही है, इस तरह के उपकरण पोल्ट्री और संभावित रूप से मनुष्यों में भी बीमारियों के इलाज के लिए वायरल थेरेपी के वादे को व्यावहारिक वास्तविकता में बदलने के लिए महत्वपूर्ण होंगे।