Rapid and sensitive qPCR-based quantification of Salmonella Gallinarum Bacteriophages cocktail (SAL3)

In de voortdurende strijd tegen bacteriën die niet langer reageren op standaardmedicijnen, wenden wetenschappers zich tot de eigen roofdieren van de natuur: virussen die alleen bacteriën infecteren. Deze virussen, bekend als bacteriofagen, fungeren als microscopische jagers die specifieke bacteriestammen opsporen, hen binnendringen en hen van binnenuit vernietigen. Omdat ze zo precies zijn, bieden ze een veelbelovend alternatief voor breedspectrumantibiotica, die ook gunstige microben kunnen schaden samen met de slechte. Deze aanpak is bijzonder belangrijk in de pluimveehouderij, waar een specifief type bacterie genaamd Salmonella Gallinarum een ernstige ziekte veroorzaakt die bekend staat als vogeltyfus. Om deze virale jagers effectief te gebruiken, moeten boeren en onderzoekers ze mengen in een "cocktail", een oplossing die verschillende soorten fagen bevat die samenwerken. Een grote hindernis is echter altijd geweest om precies te weten hoeveel van elk virus aanwezig is in het mengsel. Als de balans niet goed is, kan de behandeling falen.

Traditioneel tellen wetenschappers deze virussen met een methode die inhoudt dat ze ze kweken op een bed van bacteriën in een petrischaal. Ze wachten tot de virussen de bacteriën doden en heldere, cirkelvormige vlekken vormen die plaques worden genoemd. Hoewel deze methode betrouwbaar is, is het traag en duurt het meer dan een halve dag voordat er resultaten zijn, en het heeft moeite wanneer meerdere typen virussen gemengd zijn omdat de vlekken vaak identiek lijken. Een team van onderzoekers aan de Universiteit van de Punjab in Pakistan heeft nu een veel snellere manier ontwikkeld om dit probleem op te lossen. Ze hebben een moleculaire test ontwikkend die drie specifieke virussen in één enkel mengsel in slechts een paar uur kan identificeren en tellen, wat een nieuw niveau van snelheid en precisie biedt voor het voorbereiden van deze levensreddende behandelingen.

De onderzoekers richtten zich op een specifieke cocktail genaamd SAL3, die drie verschillende virussen bevat die ontworpen zijn om Salmonella Gallinarum op te sporen. Deze virussen, genaamd SGP9, SGP13 en Frank, werden geïsoleerd en in het lab gekweekt. De uitdaging was om te achterhalen hoeveel van elk virus aanwezig was zonder te wachten tot ze bacteriën doodden in een schaal. In plaats van te wachten tot de virussen hun werk deden, keken het team direct naar het genetisch materiaal in hen. Ze ontwierpen piepkleine moleculaire sondes, die fungeren als zeer specifieke zoeklichten, die de unieke DNA-sequentie van elk virus kunnen vinden en eraan kunnen binden. Wanneer deze sondes hun doelwit vonden, gaven ze een signaal af dat door een machine gemeten kon worden, waardoor de onderzoekers de virussen konden tellen op basis van de hoeveelheid aanwezig genetisch materiaal.

Om ervoor te zorgen dat hun nieuwe methode nauwkeurig was, bouwde het team eerst een referentiesysteem. Ze namen kleine stukjes van het virale DNA en plaatsten deze in circulaire DNA-moleculen genaamd plasmiden. Door een reeks oplossingen te maken met bekende hoeveelheden van deze plasmiden, konden ze een kaart tekenen die de sterkte van het signaal van de machine koppelde aan het exacte aantal virale genomen. Deze kalibratie stelde hen in staat om de signalen uit hun monsters te vertalen naar precieze aantallen. Ze testten dit systeem op de drie virussen afzonderlijk en ontdekten dat het zelfs twee tot twintig virale genomen in een enkele reactie kon detecteren, een gevoeligheidsniveau dat ver boven wat de traditionele schaalmethode kan bereiken ligt.

Wanneer de onderzoekers hun nieuwe snelle test vergeleken met de oude schaalmethode, vonden ze een consistent patroon. De nieuwe test rapporteerde consequent een hoger aantal virussen dan de schaalmethode. Dit verschil is geen fout, maar een reflectie van wat elke methode daadwerkelijk telt. De schaalmethode telt alleen virussen die volledig levend en in staat zijn om een bacterie te infecteren om een plaque te vormen. De nieuwe test telt echter elk virusdeeltje dat zijn genetisch materiaal intact heeft, inclusief diegenen die beschadigd of niet in staat zijn een gastheer te infecteren. De onderzoekers ontdekten dat de ratio tussen de nieuwe test en de oude methode voor elk specifiek virus constant was. Bijvoorbeeld, de nieuwe test vond ongeveer zeven keer meer SGP13-virussen dan de schaalmethode, terwijl de ratio voor het Frank-virus ongeveer zes op één was. Deze consistentie betekent dat, hoewel de aantallen verschillen, de nieuwe test een betrouwbare manier biedt om het totale aantal virusdeeltjes in een batch te schatten.

Om een telling te krijgen die dichter bij de traditionele methode lag, voegde het team een stap toe aan hun proces. Ze behandelden het virusmengsel met een enzym dat werkt als een schaar, die losse DNA-stukjes die in de oplossing rondzweven, doorknipt. Dit enzym kan de stevige buitenkant van een gezond virus niet binnendringen, waardoor het genetisch materiaal in de intacte virussen ongemoeid laat. Na deze behandeling telde de nieuwe test alleen de virussen die volledig beschermd waren door hun schillen. De resultaten van dit behandelde monster stemden zeer nauw overeen met de tellingen van de traditionele schaalmethode, wat bevestigde dat de nieuwe test het aantal infectieuze virussen nauwkeurig kon meten als het monster correct werd voorbereid.

De ware kracht van deze nieuwe aanpak werd aangetoond toen de onderzoekers alle drie de virussen samenmengden om de uiteindelijke SAL3-cocktail te maken. In het verleden zou het onderscheiden van de verschillende virussen in een dergelijk mengsel met de schaalmethode bijna onmogelijk zijn geweest, omdat hun plaques er hetzelfde uitzien. Met behulp van een techniek genaamd multiplexing draaide het team hun test met alle drie de specifieke sondes tegelijkertijd. De machine kon de virussen direct van elkaar onderscheiden omdat elke sonde was voorzien van een ander gekleurd signaal. De resultaten toonden aan dat de test de hoeveelheid van elk virus in het mengsel nauwkeurig kon meten, waarbij de resultaten overeenkwamen met de verwachte hoeveelheden op basis van hoeveel van elk virus was toegevoegd. Dit bewees dat de methode complexe mengsels kon verwerken zonder dat de virussen de resultaten in de war maakten.

De voordelen van deze nieuwe methode strekken zich uit voorbij alleen nauwkeurigheid. Het hele proces duurt minder dan drie uur van begin tot eind, vergeleken met de twaalf uur of meer die de traditionele schaalmethode vereist. Deze snelheid is cruciaal voor kwaliteitscontrole in de productie, om ervoor te zorgen dat elke batch van de virale cocktail consistent is voordat deze wordt gebruikt. De onderzoekers ontdekten ook dat hun nieuwe methode zeer reproduceerbaar was, wat betekent dat als ze hetzelfde monster meerdere keren uitvoerden, ze bijna elke keer hetzelfde resultaat kregen. Deze betrouwbaarheid is essentieel voor het ontwikkelen van behandelingen waar artsen en boeren op kunnen vertrouwen.

Door snelheid, gevoeligheid en het vermogen om tussen verschillende virussen in één enkel mengsel te onderscheiden te combineren, vormt deze studie een belangrijke stap voorwaarts in de ontwikkeling van fagentherapie. Het biedt een manier om ervoor te zorgen dat de virale cocktails die worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, correct gebalanceerd zijn, wat de effectiviteit tegen resistente bacteriën maximaliseert. Hoewel de traditionele methode nog steeds nuttig is om te bevestigen dat virussen daadwerkelijk bacteriën kunnen infecteren, vult deze nieuwe moleculaire aanpak een kritiek gat door wetenschappers in staat te stellen snel en duidelijk het volledige beeld te krijgen van wat er in hun oplossing zit. Terwijl de wereld kijkt naar alternatieven voor antibiotica, zullen instrumenten zoals deze essentieel zijn om de belofte van virale therapie om te zetten in een praktische realiteit voor de behandeling van ziekten in de pluimveehouderij en potentieel ook bij mensen.