Engineered subtilisin protease degrades active KRAS in cancer cells leading to differential cell targeting
एक इंजीनियर की गई सबटिलासिन प्रोटीज (RASp) विशेष रूप से अपने स्विच II क्षेत्र पर सक्रिय KRAS G12C को लक्षित और विघटित करती है, जो प्रभावी रूप से डाउनस्ट्रीम MEK-ERK सिग्नलिंग को दबाती है और गैर-कैंसरयुक्त नियंत्रणों को सुरक्षित रखते हुए KRAS-निर्भर कैंसर कोशिकाओं में चयनात्मक कोशिका मृत्यु प्रेरित करती है।
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प्रत्येक जीवित प्राणी की कोशिकाओं के भीतर, स्विचों की एक जटिल प्रणाली होती है जो कोशिका को बताती है कि कब बढ़ना है और कब रुकना है। इन स्विचों में से एक सबसे महत्वपूर्ण प्रोटीन है जिसे RAS कहा जाता है। एक स्वस्थ कोशिका में, RAS एक सतर्क प्रबंधक की तरह कार्य करता है, जो कोशिका को विभाजित होने में मदद करने के लिए केवल तभी चालू होता है जब उसे एक विशिष्ट संकेत प्राप्त होता है, और फिर उतनी ही तेज़ी से बंद हो जाता है। हालाँकि, जब RAS बनाने वाला जीन उत्परिवर्तित (mutate) हो जाता है, तो यह स्विच "ऑन" स्थिति में अटक जाता है। इसके कारण कोशिका बिना रुके बढ़ती और विभाजित होती रहती है, जिससे कैंसर होता है। दशकों से, वैज्ञानिक इस टूटे हुए स्विच को ठीक करने का तरीका खोजने के लिए संघर्ष कर रहे हैं। यह प्रोटीन बहुत चिकना है और इसमें वे गहरे पॉकेट्स नहीं हैं जहाँ अधिकांश दवाएं आमतौर पर जुड़ती हैं, जिससे इसे पारंपरिक दवाओं के माध्यम से लक्षित करना बेहद कठिन हो गया है। हालांकि कुछ छोटे अणुओं (small molecules) के साथ प्रगति हुई है जो स्विच को ब्लॉक करते हैं, लेकिन एक अधिक सीधा दृष्टिकोण काफी हद तक अनछुआ रहा है: कोशिका से उस टूटे हुए स्विच को पूरी तरह से बाहर निकाल देना।
मैरीलैंड विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस सीधे दृष्टिकोण की ओर एक साहसी कदम उठाया है, जिसमें एक जैविक उपकरण को इंजीनियर किया गया है जो सक्रिय, कैंसर पैदा करने वाले RAS का पता लगाने और उसे नष्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। उन्होंने एक कस्टम-मेड एंजाइम बनाया, जो एक प्रकार का प्रोटीन काटने वाला (protein cutter) है, जो आणविक कैंची की तरह कार्य करता है। इस उपकरण को एक विशिष्ट आकार को पहचानने के लिए बनाया गया था जो केवल सक्रिय, खतरनाक RAS का रूप लेता है। जब एंजाइम इस आकार को पाता है, तो वह प्रोटीन को काट देता है, जिससे वह टूट जाता है और बेकार हो जाता है। शोधकर्ताओं ने इस उपकरण का परीक्षण उन कैंसर कोशिकाओं में किया जो जीवित रहने के लिए पूरी तरह से इस टूटे हुए स्विच पर निर्भर करती हैं, और परिणाम आश्चर्यजनक थे: कोशिकाएं तेजी से मर गईं, जबकि सामान्य कोशिकाएं अप्रभावित रहीं।
इस खोज की कहानी स्वयं RAS प्रोटीन की प्रकृति से शुरू होती है। RAS मुख्य रूप से दो अवस्थाओं में मौजूद होता है: एक निष्क्रिय अवस्था, जहाँ यह GDP नामक अणु से जुड़ा होता है, और एक सक्रिय अवस्था, जहाँ यह GTP से जुड़ा होता है। सक्रिय अवस्था में, प्रोटीन अपना आकार थोड़ा बदल लेता है, जिससे एक छिपा हुआ क्षेत्र उजागर हो जाता है जो सामान्यतः अंदर दबा रहता है। यही उजागर क्षेत्र मुख्य कुंजी है। शोधकर्ताओं ने महसूस किया कि यदि वे एक ऐसा कटर बना सकें जो केवल इस उजागर आकार को पहचानता है, तो वे हानिकारक, सक्रिय RAS को लक्षित कर सकते हैं और हानिरहित, निष्क्रिय RAS को अकेला छोड़ सकते हैं। वे Bacillus subtilis नामक बैक्टीरिया में पाए जाने वाले एक प्राकृतिक एंजाइम, 'सबटिलाइसिन' (subtilisin) की ओर मुड़े। यह एंजाइम एक शक्तिशाली कटर है, लेकिन अपने प्राकृतिक रूप में, यह बहुत व्यापक है और कई चीजों को काट सकता है जिन्हें नहीं काटना चाहिए। टीम ने इस एंजाइम को अत्यधिक विशिष्ट बनाने के लिए इसे पुन: इंजीनियर किया, इसे केवल सक्रिय RAS प्रोटीन पर मौजूद उजागर क्षेत्र को खोजने के लिए प्रशिक्षित किया। उन्होंने अपनी रचना को RASProtease, या संक्षेप में RASp नाम दिया।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह नया उपकरण नियंत्रित किया जा सके, वैज्ञानिकों ने इसमें एक सुरक्षा स्विच जोड़ा। उन्होंने एंजाइम को इस तरह डिज़ाइन किया कि वह केवल तभी सक्रिय होगा जब एक विशिष्ट सहायक अणु मौजूद हो। उन्होंने दो संस्करण बनाए: एक जिसे चालू करने के लिए इमिडाज़ोल (imidazole) नामक रसायन की आवश्यकता थी, और दूसरा जिसे नाइट्राइट (nitrite) की आवश्यकता थी। नाइट्राइट एक ऐसा पदार्थ है जो शरीर में स्वाभाविक रूप से होता है और अक्सर कैंसर कोशिकाओं में उच्च सांद्रता में पाया जाता है, जबकि इमिडाज़ोल मानव कोशिकाओं में स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं होता है। इन सहायकों का उपयोग करके, शोधकर्ता सटीक रूप से नियंत्रित कर सके कि एंजाइम कब और कहाँ काटना शुरू करेगा। अपने प्रारंभिक परीक्षणों में, उन्होंने पाया कि नाइट्राइट पर निर्भर संस्करण अपने काम में कहीं अधिक कुशल था, जो इमिडाज़ोल वाले संस्करण की तुलना में अपने लक्ष्य को बहुत तेज़ी से काट देता था।
इसके बाद शोधकर्ताओं ने सरल रासायनिक परीक्षणों से आगे बढ़कर जीवित कोशिकाओं का उपयोग किया ताकि यह देख सकें कि क्या उनका उपकरण एक वास्तविक जैविक वातावरण में काम कर सकता है। उन्होंने एक सामान्य प्रयोगशाला सेल लाइन से शुरुआत की जिसे HEK 293T कहा जाता है, जिसमें सामान्य, स्वस्थ RAS होता है। उन्होंने इन कोशिकाओं में एंजाइम पेश किया और देखा कि क्या हुआ। जब एंजाइम चालू हुआ, तो उसने सफलतापूर्वक RAS प्रोटीन को काट दिया, लेकिन कोशिकाएं स्वयं नहीं मरीं। यह एक महत्वपूर्ण निष्कर्ष था क्योंकि इससे पता चला कि एंजाइम केवल कोशिका के भीतर सब कुछ बेतरतीब ढंग से नष्ट नहीं कर रहा था; बल्कि वह सामान्य कोशिकाओं को, जो उसके अस्तित्व के लिए RAS पर निर्भर नहीं हैं, तत्काल अराजकता पैदा किए बिना अपना काम कर रहा था।
इसके बाद, टीम ने अपना ध्यान एक बहुत अधिक खतरनाक लक्ष्य की ओर लगाया: MIA PaCa-2 नामक एक अग्नाशय कैंसर (pancreatic cancer) सेल लाइन। ये कोशिकाएं RAS जीन में एक विशिष्ट उत्परिवर्तन, जिसे G12C कहा जाता है, द्वारा संचालित होती हैं, जो प्रोटीन को सक्रिय, कैंसर पैदा करने वाली अवस्था में लॉक कर देता है। ये कोशिकाएं बढ़ने और जीवित रहने के लिए इस टूटे हुए स्विच पर पूरी तरह निर्भर हैं। शोधकर्ताओं ने इन कैंसर कोशिकाओं में अपने नाइट्राइट-निर्भर एंजाइम को पेश किया और इसे सक्रिय किया। परिणाम नाटकीय था। 24 घंटों के भीतर, एंजाइम ने सक्रिय RAS प्रोटीनों को खोजा और काट दिया। जैसे-जैसे RAS प्रोटीन नष्ट हुए, वे संकेत जो कैंसर कोशिकाओं को बढ़ने और विभाजित होने के लिए कहते थे, कट गए। RAS प्रोटीन के बिना कार्य करने में असमर्थ, कैंसर कोशिकाएं मरने लगीं। शोधकर्ताओं ने देखा कि लगभग सभी कैंसर कोशिकाएं एक दिन के भीतर समाप्त हो गईं, जो सामान्य कोशिकाओं में होने वाली विनाश की तुलना में बहुत अधिक था।
यह समझने के लिए कि वास्तव में यह कैसे हुआ, वैज्ञानिकों ने कोशिकाओं के भीतर संकेतों का बारीकी से अध्ययन किया। उन्होंने पाया कि जब एंजाइम ने RAS प्रोटीन को काटा, तो उसके बाद चलने वाली संचार की पूरी श्रृंखला भी बंद हो गई। इसमें MEK और ERK नामक प्रोटीनों वाला एक मार्ग (pathway) भी शामिल था, जो कोशिका को विभाजित होने के लिए बताने हेतु महत्वपूर्ण हैं। संकेत के स्रोत को हटाकर, एंजाइम ने प्रभावी रूप से कैंसर के विकास इंजन को शांत कर दिया। उन्होंने यह भी देखा कि AKT नामक प्रोटीन वाला एक अन्य मार्ग, जो कोशिकाओं को जीवित रहने में मदद करता है, भी बंद हो गया। इसने पुष्टि की कि एंजाइम केवल एक प्रोटीन को नहीं काट रहा था, बल्कि उस पूरे नेटवर्क को ध्वस्त कर रहा था जिस पर कैंसर कोशिकाएं निर्भर थीं।
इस कार्य के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक हमले की सटीकता है। शोधकर्ताओं ने पाया कि सक्रिय रूप में RAS को लक्षित करने की एंजाइम की क्षमता इस बात पर निर्भर करती है कि कितना एंजाइम मौजूद है। जब उन्होंने बड़ी मात्रा में एंजाइम का उपयोग किया, तो इसने प्रोटीन के सक्रिय और निष्क्रिय दोनों रूपों को काट दिया। हालाँकि, जब उन्होंने बहुत कम, सीमित मात्रा का उपयोग किया—जैसा कि वास्तविक उपचार में हो सकता है—तो एंजाइम अत्यधिक चयनात्मक (selective) हो गया। इसने निष्क्रिय, सामान्य RAS को अनदेखा कर दिया और अपनी पूरी ऊर्जा लगभग विशेष रूप से सक्रिय, कैंसर पैदा करने वाले संस्करण पर केंद्रित कर दी। यह चयनात्मकता महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका अर्थ है कि उपचार संभावित रूप से स्वस्थ कोशिकाओं को बचाते हुए कैंसर कोशिकाओं को मार सकता है, जो कैंसर चिकित्सा का परम लक्ष्य (holy grail) है।
अध्ययन ने यह भी पता लगाया कि विभिन्न वातावरणों में एंजाइम कैसा व्यवहार करता है। उन्होंने पाया कि एंजाइम सेल एक्सट्रैक्ट (cell extracts) और जीवित कोशिकाओं में अच्छी तरह से काम करता है, जिससे सिद्ध होता है कि यह एक वास्तविक जैविक प्रणाली के जटिल परिवेश में कार्य कर सकता है। उन्होंने परमाणु चुंबकीय अनुनाद (nuclear magnetic resonance) नामक तकनीक का उपयोग करके वास्तविक समय में एंजाइम को प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करते हुए देखा, जिससे पुष्टि हुई कि एंजाइम वास्तव में काटने से पहले सक्रिय प्रोटीन के विशिष्ट आकार से बंध रहा था। विवरण के इस स्तर ने उन्हें विश्वास दिलाया कि तंत्र ठीक वैसा ही काम कर रहा था जैसा उन्होंने डिज़ाइन किया था।
इस कार्य के निहितार्थ भविष्य के कैंसर उपचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। लंबे समय से, मानव कोशिका के भीतर एक विशिष्ट प्रोटीन को काटने के लिए एंजाइम का उपयोग करना बहुत कठिन माना जाता था। यह शोध दिखाता है कि एक ऐसा आणविक उपकरण डिजाइन करना संभव है जो एक विशिष्ट लक्ष्य को खोज सके, उसके आकार को पहचान सके और उच्च सटीकी के साथ उसे नष्ट कर सके। यह अध्ययन प्रयोगशाला सेटिंग में सेल कल्चर का उपयोग करके किया गया था, लेकिन यह नए प्रकार के उपचार विकसित करने के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करता है। सक्रिय प्रोटीन को किसी दवा के साथ ब्लॉक करने के बजाय, वैज्ञानिक ऐसे उपकरण डिजाइन कर सकते हैं जो समस्या को पूरी तरह से हटा दें।
शोधकर्ताओं ने यह भी नोट किया कि उनके उपकरण को अन्य प्रोटीनों या विभिन्न प्रकार के कैंसर को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एंजाइम का डिज़ाइन लचीला है, जिसका अर्थ है कि इसे अन्य आकारों या उत्परिवर्तनों को पहचानने के लिए पुनः प्रशिक्षित किया जा सकता है। यह व्यक्तिगत उपचार (personalized treatments) बनाने के लिए एक नया मार्ग खोलता है जो रोगी के ट्यूमर की विशिष्ट आनुवंशिक संरचना के अनुरूप हो। यह तथ्य कि एंजाइम को एक सहायक अणु द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, सुरक्षा की एक और परत जोड़ता है, जिससे डॉक्टरों को आवश्यकतानुसार उपचार को चालू और बंद करने की अनुमति मिलती है।
अंत में, यह शोध कैंसर को नियंत्रित करने के लिए एक शक्तिशाली नई रणनीति को प्रदर्शित करता है। एक महत्वपूर्ण कैंसर प्रोटीन के सक्रिय रूप का पीछा करने वाले प्रोटीन कटर को इंजीनियर करके, शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि स्वस्थ कोशिकाओं को अकेला छोड़ते हुए कैंसर कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से नष्ट करना संभव है। यह कार्य पारंपरिक दवाओं की सीमाओं से परे जाता है और एक ऐसे भविष्य की झलक देता है जहाँ हम बीमारी के आणविक तंत्र को सटीक रूप से संपादित (edit) कर सकते हैं। परिणाम केवल एक सैद्धांतिक संभावना नहीं हैं बल्कि प्रयोगशाला में एक मापी गई वास्तविकता हैं, जो दर्शाते हैं कि सही डिज़ाइन के साथ, हम कैंसर को चलाने वाले तंत्रों को मात दे सकते हैं।
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