Engineered subtilisin protease degrades active KRAS in cancer cells leading to differential cell targeting

在构成每一个生命体的细胞内部，存在着一个复杂的开关系统，它告诉细胞何时生长以及何时停止。这些开关中最重要的一个是名为 RAS 的蛋白质。在健康的细胞中，RAS 扮演着一名谨慎经理的角色，仅在接收到特定的信号以帮助细胞分裂时才会开启，并在完成后迅速关闭。然而，当制造 RAS 的基因发生突变时，这个开关就会卡在“开启”位置。这会导致细胞在不停歇的情况下进行生长和分裂，从而导致癌症。几十年来，科学家们一直致力于寻找修复这个损坏开关的方法。由于该蛋白质非常光滑，且缺乏大多数药物通常可以附着的深层口袋，这使得它在利用传统药物进行靶向治疗方面极其困难。虽然通过阻断开关的小分子药物已经取得了一些进展，但一种更直接的方法在很大程度上仍未被探索：即直接将这个损坏的开关从细胞中切除。

马里兰大学的一个研究小组采取了一个大胆的步骤，朝着这种直接方法迈进，他们设计了一种生物工具，旨在追踪并摧毁具有致癌性的活性 RAS 版本。他们创造了一种定制的酶，一种类型的蛋白质切割器，其作用类似于分子剪刀。这个工具被设计用来识别只有在活性、危险状态下的 RAS 才会呈现的特定形状。当酶发现这种形状时，它会剪断蛋白质，将其切碎并使其失效。研究人员在完全依赖这种损坏开关来生存的癌细胞中测试了这一工具，结果令人震惊：癌细胞迅速死亡，而正常细胞则毫发无伤。

这个发现的故事始于 RAS 蛋白质本身的特性。RAS 以两种主要状态存在：一种是不活跃状态，此时它与一种称为 GDP 的分子结合；另一种是活跃状态，此时它与 GTP 结合。在活跃状态下，蛋白质的形状会发生轻微变化，从而暴露出一个平时隐藏起来的区域。这个暴露的区域就是关键所在。研究人员意识到，如果他们能制造出一个只识别这种暴露形状的切割器，他们就能针对危险的活性 RAS，同时留下无害的不活跃 RAS。他们转向了一种在名为“枯草芽孢杆菌”（Bacillus subtilis）的细菌中发现的天然酶——枯草蛋白酶（subtilisin）。这种酶是一种强大的切割器，但在其天然形式下，它的作用范围太广，会切断许多不该切的东西。团队重新设计了这种酶，使其具有高度特异性，训练它只寻找活性 RAS 蛋白上暴露的区域。他们将他们的创造物命名为 RASProtease，简称 RASp。

为了确保这个新工具可以得到控制，科学家们添加了一个安全开关。他们设计了这种酶，使其只有在存在特定的辅助分子时才会变得活跃。他们创造了两个版本：一个需要一种称为咪唑（imidazole）的化学物质来开启，另一个则需要亚硝酸盐（nitrite）。亚硝酸盐是人体内天然存在的物质，并且在癌细胞中通常浓度较高，而咪唑在人体细胞中则不存在。通过使用这些辅助分子，研究人员可以精确控制酶何时以及何处开始切割。在初步测试中，他们发现需要亚硝酸盐的版本在工作效率上远高于需要咪唑的版本，切割目标的速度也更快。

随后，研究人员从简单的化学测试转向了活细胞，以观察他们的工具是否能在真实的生物环境中发挥作用。他们首先使用了一种常见的实验室细胞系，称为 HEK 293T，这种细胞含有正常的、健康的 RAS。他们将这种酶引入这些细胞中并观察发生了什么。当酶被激活时，它成功地切割了 RAS 蛋白，但细胞本身并没有死亡。这是一个重要的发现，因为它表明该酶并非在随机破坏细胞内的所有东西；它在完成任务的同时，并没有对那些不依赖 RAS 生存的正常细胞造成即时的混乱。

接着，团队将注意力转向了一个更危险的目标：一种名为 MIA PaCa-2 的胰腺癌细胞系。这些细胞是由一种被称为 G12C 的特定 RAS 基因突变驱动的，这种突变使蛋白质锁定在活跃的、致癌的状态。这些细胞完全依赖这个损坏的开关来生长和生存。研究人员将他们的亚硝酸盐依赖型酶引入这些癌细胞并将其激活。结果是戏剧性的。在 24 小时内，该酶找到了并切割了活性 RAS 蛋白。随着 RAS 蛋白被破坏，告知癌细胞生长和分裂的信号也被切断了。由于失去了主要的驱动力，癌细胞无法维持功能，开始走向死亡。研究人员观察到，几乎所有的癌细胞都在一天之内消失了，这种破坏程度远超他们在正常细胞中所观察到的情况。

为了理解这究竟是如何发生的，科学家们仔细观察了细胞内的信号。他们发现，当酶切割 RAS 蛋白时，随之而来的整个通信链也随之关闭。这包括涉及被称为 MEK 和 ERK 的蛋白质的通路，这些蛋白质对于指示细胞分裂至关重要。通过移除信号源，该酶有效地沉默了癌症的生长引擎。他们还看到，涉及有助于细胞生存的蛋白质 AKT 的另一条通路也被关闭了。这证实了该酶不仅仅是在切割单个蛋白质，而是在拆解癌细胞所依赖的整个网络。

这项工作的最显著方面之一是攻击的精准度。研究人员发现，该酶针对活性 RAS 的能力取决于所含酶的数量。当他们使用大量的酶时，它会同时切割活性和不活跃形式的蛋白质。然而，当他们使用极少量的、更接近于实际治疗中的量时，该酶变得具有高度选择性。它忽略了不活跃的、正常的 RAS，并将能量几乎完全集中在活跃的、致癌的版本上。这种选择性至关重要，因为这意味着该疗法有可能在杀死癌细胞的同时保护健康细胞，而这正是癌症治疗的终极目标。

研究还探讨了该酶在不同环境下的表现。他们发现该酶在细胞提取物和活细胞中都能很好地工作，证明了它可以在真实的生物系统中发挥作用。他们使用核磁共振技术实时观察酶与蛋白质的相互作用，确认了该酶确实在切割之前先结合到了活性蛋白质的特定形状上。这种细致的水平让他们确信，其作用机制正如他们设计的方案那样运作。

这项工作的意义对于癌症治疗的未来具有重大影响。长期以来，使用酶在人体细胞内切割特定蛋白质的想法被认为难以实现。这项研究表明，设计一种能够寻找特定目标、识别其形状并以高精度将其摧毁的分子工具是可能的。虽然这项研究是在实验室环境下使用细胞培养物进行的，但它为开发新型疗法奠定了坚实的基础。这种能够选择性针对蛋白质活性形式的方法，为对抗疾病提供了新的思考方式。科学家们不再仅仅尝试用药物阻断蛋白质，而是可能会设计出直接移除问题的工具。

研究人员还指出，他们的工具可以被改编用于针对其他蛋白质甚至不同类型的癌症。该酶的设计具有灵活性，这意味着它有可能经过“再训练”，以识别其他形状或突变。这为创造针对患者肿瘤特定遗传特征的个性化治疗开辟了新的途径。该酶可以受辅助分子控制的事实，增加了另一层安全性，允许医生根据需要开启或关闭治疗。

最后，这篇论文展示了一种控制癌症的强大新策略。通过设计一种专门猎捕关键癌症蛋白活性形式的蛋白质切割器，研究人员证明了可以选择性地摧毁癌细胞，同时让健康细胞保持完好。这项工作超越了传统药物的局限性，让我们得以窥见一个我们可以精确编辑疾病分子机制的未来。这些结果不仅是理论上的可能，而且是在实验室中经过测量的现实，这表明只要有正确的方案设计，我们就能智取驱动癌症产生的那些机制。