RHD/RHCE paralogous misalignment at exon 4 causes false-negative whole-exome sequencing result in a serologically confirmed DFR partial- D individual: Case report

जब भी किसी व्यक्ति को रक्त चढ़ाया जाता है, तो उनकी प्रतिरक्षा प्रणाली (इम्यून सिस्टम) आने वाली कोशिकाओं की जांच एक विशिष्ट सेट के मार्करों के लिए करती है, ठीक वैसे ही जैसे एक सुरक्षा गार्ड गेट पर आईडी चेक करता है। इन मार्करों में सबसे महत्वपूर्ण मार्कर Rh सिस्टम से संबंधित है, जो लाल रक्त कोशिकाओं की सतह पर मौजूद प्रोटीनों का एक समूह है और सुरक्षित रक्त आधान (ट्रांसफ्यूजन) के लिए ABO सिस्टम के बाद दूसरे स्थान पर आता है। इन प्रोटीनों को बनाने वाले जीन एक बहुत ही शाब्दिक अर्थ में जुड़वा हैं; दो जीन, जिन्हें RHD और RHCE कहा जाता है, हमारे डीएनए में एक-दूसरे के बगल में स्थित हैं और एक-दूसरे की लगभग समान प्रतियां हैं, जो उनके जेनेटिक कोड का लगभग 97 प्रतिशत साझा करती हैं। क्योंकि वे इतने समान हैं, शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली कभी-कभी भ्रमित हो सकती है। यदि किसी व्यक्ति में RHD जीन का थोड़ा परिवर्तित संस्करण है, तो उनकी प्रतिरक्षा प्रणाली उस प्रोटीन को पूरी तरह से "स्वयं" (self) के रूप में नहीं पहचान सकती है, जिससे उन्हें मानक Rh-पॉजिटिव रक्त प्राप्त होने पर एक खतरनाक प्रतिक्रिया हो सकती है। यह स्थिति, जिसे 'पार्शियल-डी फेनोटाइप' (partial-D phenotype) के रूप में जाना जाता है, एक गंभीर चिकित्सा चिंता है क्योंकि यह भविष्य के रक्त आदानों पर शरीर के हमले का कारण बन सकती है।

इन प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, डॉक्टर अक्सर 'होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग' (whole-exome sequencing) नामक तकनीक का उपयोग करके रोगी की आनुवंशिक संरचना निर्धारित करने का प्रयास करते हैं। यह विधि हमारे डीएनए के उन हिस्सों को पढ़ती है जिनमें प्रोटीन बनाने के निर्देश होते हैं, जिससे वैज्ञानिकों को बीमारी का कारण बनने वाले विशिष्ट परिवर्तनों को खोजने की अनुमति मिलती है। यह दुनिया भर के अस्पतालों और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली उपकरण है। हालाँकि, जब ये आनुवंशिक निर्देश लगभग समान जुड़वा हों, तो यह तकनीक एक अनूठी चुनौती का सामना करती है। डीएनए के छोटे टुकड़े जिन्हें मशीन पढ़ती है, वे इतने समान दिख सकते हैं कि कंप्यूटर यह नहीं बता पाता कि वे किस जुड़वा से आए हैं। पाकिस्तान और चीन के शोधकर्ताओं की एक हालिया केस रिपोर्ट ठीक इसी बात पर प्रकाश डालती है कि कैसे यह भ्रम एक खतरनाक गलती का कारण बन सकता है, जहाँ एक ज्ञात, जोखिम भरे रक्त प्रकार वाले व्यक्ति को गलत तरीके से सुरक्षित बताया गया था।

कहानी की शुरुआत एक तैंतीस वर्षीय व्यक्ति से होती है, जिसका पहले पारंपरिक रक्त टाइपिंग विधियों द्वारा परीक्षण किया जा चुका था। इन पुरानी, भौतिक परीक्षणों ने, जो यह देखने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करती हैं कि रक्त कोशिकाएं कैसे प्रतिक्रिया देती हैं, पुष्टि की कि उसमें एक विशिष्ट 'पार्शियल-डी' प्रकार था जिसे DFR कहा जाता है। यह एक अच्छी तरह से प्रलेखित स्थिति है जहाँ RHD जीन का एक छोटा हिस्सा उसके जुड़वा (RHCE) के एक टुकड़े के साथ बदल दिया गया है। यह बदलाव जेनेटिक कोड के तीन विशिष्ट अक्षरों को बदल देता है, जिससे प्रोटीन का आकार इतना बदल जाता है कि वह उस व्यक्ति के लिए मानक Rh-पॉजिटिव रक्त प्राप्त करना खतरनाक बना देता है। इस स्पष्ट सीरोलॉजिकल साक्ष्य के बावजूद, मेडिकल टीम ने होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग टेस्ट चलाने का निर्णय लिया, ताकि आनुवंशिक कारण की पुष्टि की जा सके। उन्होंने डेटा का विश्लेषण करने के लिए रक्त समूह के जीन खोजने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए एक प्रोग्राम सहित तीन अलग-अलग कंप्यूटर प्रोग्रामों का उपयोग किया।

परिणाम पूरी तरह से विफल रहे। तीनों कंप्यूटर प्रोग्रामों ने उस व्यक्ति के जेनेटिक डेटा को देखा और रिपोर्ट किया कि उसका RHD जीन पूरी तरह से सामान्य था। उन्होंने कोई त्रुटि, कोई बदलाव या पार्शियल-डी स्थिति का कोई संकेत नहीं पाया। वास्तव में, सॉफ्टवेयर इतना आश्वस्त था कि जीन सामान्य था कि उसने उस विशिष्ट परिवर्तन को भी मिस कर दिया जिसे रक्त परीक्षण द्वारा पहचाना गया था। शोधकर्ताओं ने महसूस किया कि कंप्यूटर ने केवल त्रुटि को छोड़ा नहीं था; बल्कि उसे डीएनए द्वारा धोखा दिया गया था। जिस जीन क्षेत्र में यह बदलाव हुआ था, वह अपने जुड़वा जीन के इतना समान है कि कंप्यूटर ने, कुशलता बरतने के प्रयास में, उस क्षेत्र के सभी डीएनए टुकड़ों को गलत जुड़वा को सौंप दिया। उसने उन रीड्स (reads) को RHCE जीन पर रख दिया, जिससे RHD जीन उस विशिष्ट स्थान पर पूरी तरह से खाली दिखाई देने लगा।

चूंकि कंप्यूटर ने RHD स्थान पर कोई डीएनए नहीं देखा, इसलिए उसने मान लिया कि जीन गायब है या सामान्य है, न कि परिवर्तित। शोधकर्ताओं ने डेटा से अपने जुड़वा जीन, RHCE को देखकर इसकी पुष्टि की। उन्होंने पाया कि RHCE जीन में डीएनए का एक विशाल मात्रा में डेटा था, जो अपेक्षित से कहीं अधिक था, क्योंकि इसने गलती से RHD के रीड्स को सोख लिया था। इस पैटर्न ने सिद्ध कर दिया कि डीएनए शरीर से गायब नहीं था; इसे बस गलत जगह पढ़ा और फाइल किया गया था। व्यक्ति का शरीर परिवर्तित प्रोटीन का उत्पादन कर रहा था, जैसा कि रक्त परीक्षण ने दिखाया, लेकिन सीक्वेंसिंग मशीन इसके प्रति अंधा थी क्योंकि आनुवंशिक निर्देश गलत फाइल में रखे जा रहे थे। यहाँ तक कि एक विशेष टूल भी, जिसे इन सटीक समस्याओं को हल करने के लिए बनाया गया था, त्रुटि को ठीक नहीं कर सका, क्योंकि निर्णय लेने के लिए आवश्यक डेटा गलत फाइल में रखा गया था।

यह मामला मानव जीनोम के इस विशिष्ट भाग के लिए मानक 'शॉर्ट-रीड सीक्वेंसिंग' (short-read sequencing) के उपयोग में एक मौलिक सीमा को प्रदर्शित करता है। समस्या यह नहीं है कि मशीन ने पर्याप्त गहराई से नहीं देखा या डेटा पर्याप्त नहीं था; अधिक डेटा जोड़ने से भी मदद नहीं मिलेगी क्योंकि त्रुटि उसी क्षण होती है जब कंप्यूटर डीएनए को वर्गीकृत करने का प्रयास करता है। रीड्स शारीरिक रूप से मौजूद हैं, लेकिन उन्हें गलत जीन को सौंपा जाता है, जिससे वास्तविक आनुवंशिक भिन्नता सॉफ्टवेयर के लिए अदृश्य हो जाती है। शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि इस प्रकार के रक्त समूह वाले रोगियों के लिए, खतरनाक स्थितियों को खारिज करने के लिए होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग पर भरोसा करना असुरक्षित है। वर्तमान स्वरूप में, यह तकनीक एक सामान्य जीन और एक बदले हुए (swapped) जीन के बीच अंतर नहीं कर सकती है।

ये निष्कर्ष एक सख्त अनुस्मारक के रूप में कार्य करते हैं कि हमारे सबसे उन्नत उपकरणों की भी अपनी सीमाएं होती हैं। इस रोगी के लिए, मानक जेनेटिक टेस्ट डॉक्टरों को झूठी तसल्ली दे देता कि वह मानक रक्त प्राप्त करने के लिए सुरक्षित है, एक ऐसा निष्कर्ष जो एक गंभीर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का कारण बन सकता था। उनके स्थिति को सही ढंग से पहचानने का एकमात्र तरीका पारंपरिक रक्त परीक्षण था जिसने स्वयं प्रोटीन को देखा, या नई 'लॉन्ग-रीड सीक्वेंसिंग' तकनीकों का उपयोग करना था जो डीएनए के लंबे हिस्सों को पढ़ सकती हैं और जुड़वाओं के बीच अंतर कर सकती हैं। यह मामला यह सुझाव नहीं देता कि जेनेटिक सीक्वेंसिंग बेकार है, बल्कि यह दिखाता है कि इन जटिल आनुवंशिक जुड़वाओं के लिए, भौतिक प्रोटीन को देखने की पुरानी विधियाँ रोगी की सुरक्षा के लिए अनिवार्य बनी हुई हैं। ब्लड टाइपिंग का विज्ञान विकसित होता रहता है, लेकिन जीनोम के इस कोने में, जुड़वा अभी भी इतने समान हैं कि शॉर्ट-रीड मशीन उन्हें अलग नहीं कर पाती।