RHD/RHCE paralogous misalignment at exon 4 causes false-negative whole-exome sequencing result in a serologically confirmed DFR partial- D individual: Case report

Ogni volta che una persona riceve una trasfusione di sangue, il suo sistema immunitario controlla le cellule in arrivo per un set specifico di marcatori, proprio come una guardia giurata che controlla i documenti d'identità a un cancello. Il più critico di questi marcatori appartiene al sistema Rh, un gruppo di proteine sulla superficie dei globuli rossi che è seconda solo al sistema ABO per importanza nelle trasfusioni sicure. I geni che costruiscono queste proteine sono gemelli in senso molto letterale; due di essi, chiamati RHD e RHCE, siedono l'uno accanto all'altro nel nostro DNA e sono copie quasi identiche l'una dell'altra, condividendo circa il 97 percento del loro codice genetico. Poiché sono così simili, il sistema immunitario del corpo può talvolta confondersi. Se una persona possiede una versione leggermente alterata del gene RHD, il suo sistema immunitario potrebbe non riconoscere la proteina come completamente "propria", portando a una reazione pericolosa se riceve sangue Rh-positivo standard. Questa condizione, nota come fenotipo partial-D, è una seria preoccupazione medica perché può causare l'attacco del corpo verso future trasfusioni.

Per prevenire queste reazioni, i medici spesso cercano di determinare la costituzione genetica di un paziente utilizzando una tecnica chiamata sequenziamento dell'intero esoma. Questo metodo legge le parti del nostro DNA che contengono le istruzioni per produrre proteine, permettendo agli scienziati di cercare cambiamenti specifici che potrebbero causare malattie. È uno strumento potente utilizzato negli ospedali e nei laboratori di ricerca in tutto il mondo. Tuttavia, quando queste istruzioni genetiche sono quasi identiche gemelle, la tecnologia affronta una sfida unica. I brevi frammenti di DNA che la macchina legge possono sembrare così simili che il computer non riesce a capire da quale gemello provengano. Un recente rapporto di casi presentato da ricercatori in Pakistan e Cina evidenzia esattamente come questa confusione possa portare a un errore pericoloso, in cui un paziente con un tipo di sangue rischioso viene erroneamente informato di essere al sicuro.

La storia inizia con un uomo di trentaquattro anni che era già stato sottoposto a test tramite metodi tradizionali di tipizzazione del sangue. Questi metodi più vecchi, fisici, che utilizzano anticorpi per vedere come le cellule del sangue reagiscono, hanno confermato che possedeva un tipo partial-D specifico noto come DFR. Questo è un tipo ben documentato di condizione in cui una piccola sezione del gene RHD è stata scambiata con un pezzo del suo gemello, RHCE. Questo scambio cambia tre lettere specifiche nel codice genetico, alterando la forma della proteina quel tanto che basta per rendere pericoloso per l'uomo ricevere sangue Rh-positivo standard. Nonostante questa chiara evidenza sierologica, l'équipe medica ha deciso di eseguire un test di sequenziamento dell'intero esoma, sperando di confermare la causa genetica. Hanno utilizzato tre diversi programmi informatici per analizzare i dati, incluso uno specificamente progettato per trovare i geni dei gruppi sanguigni.

I risultati sono stati un fallimento totale. Tutti e tre i programmi informatici hanno esaminato i dati genetici dell'uomo e hanno riportato che il suo gene RHD era perfettamente normale. Non hanno trovato errori, né scambi, né segni della condizione partial-D.로 In effetti, il software era così sicuro che il gene fosse normale da aver mancato la variazione molto specifica che era stata identificata dal test del sangue. I ricercatori si sono resi conto che il computer non aveva semplicemente mancato l'errore; era stato ingannato dal DNA stesso. La regione del gene dove è avvenuto lo scambio è così simile al gene gemello che il computer, cercando di essere efficiente, ha assegnato tutti i frammenti di DNA di quell'area al gemello sbagliato. Ha collocato le letture sul gene RHCE, lasciando il gene RHD completamente vuoto in quel punto specifico.

Poiché il computer non vedeva DNA nella posizione RHD, ha assunto che il gene fosse mancante o normale, piuttosto che alterato. I ricercatori hanno confermato questo osservando i dati del gene gemello, RHCE. Hanno scoperto che il gene RHCE era coperto da una quantità massiccia di dati del DNA, molto più di quanto previsto, perché aveva accidentalmente assorbito le letture che appartenevano a RHD. Questo schema ha dimostrato che il DNA non era mancante nel corpo; era semplicemente stato letto e archiviato nel posto sbagliato. Il corpo dell'uomo stava produendo la proteina alterata, come mostrava il test del sangue, ma la macchina di sequenziamento era cieca ad essa perché le istruzioni genetiche venivano archiviate nel file sbagliato. Persino uno strumento specializzato costruito per risolvere esattamente questi problemi non poteva correggere l'errore, perché i dati necessari per prendere una decisione non si trovavano nel file corretto.

Questo caso dimostra un limite fondamentale nell'uso del sequenziamento standard a lettura breve (short-read) per questa specifica parte del genoma umano. Il problema non è che la macchina non abbia guardato abbastanza attentamente o che i dati non fossero abbastanza profondi; aggiungere più dati non servirebbe perché l'errore avviene nel momento stesso in cui il computer cerca di smistare il DNA. Le letture sono fisicamente presenti, ma vengono assegnate al gene sbagliato, rendendo la vera variazione genetica invisibile al software. I ricercatori hanno concluso che, per pazienti con questo tipo di gruppo sanguigno, fare affidamento sul sequenziamento dell'intero esoma per escludere condizioni pericolose è insicuro. La tecnologia, nella sua forma attuale, non può distinguere tra un gene normale e uno scambiato in questa specifica regione.

I risultati fungono da severo promemoria del fatto che anche i nostri strumenti più avanzati hanno dei punti ciechi. Per questo paziente, il test genetico standard avrebbe rassicurato falsamente i medici che fosse al sicuro, una conclusione che avrebbe potuto portare a una grave reazione immunitaria. L'unico modo per identificare correttamente la sua condizione era attraverso il test del sangue tradizionale che osservava la proteina fisica, o utilizzando le più recenti tecnologie di sequenziamento a lettura lunga (long-read) che possono leggere tratti più lunghi di DNA e distinguere i gemelli. Questo caso non suggerisce che il sequenziamento genetico sia inutile, ma mostra che per certi gemelli genetici complessi, i metodi tradizionali di osservazione della proteina fisica rimangono essenziali per la sicurezza del paziente. La scienza della tipizzazione del sangue continua a evolversi, ma in questo angolo del genoma, i gemelli rimangono troppo simili perché la macchina a lettura breve possa distinguerli.