Analysis of the genetic material of immature oocytes derived embryos after short-term insemination in vitro

तकनीकी सारांश: अल्पकालिक इन विट्रो निषेचन के बाद अपरिपक्व ऊसाइट्स (Oocytes) से प्राप्त भ्रूणों के आनुवंशिक पदार्थ का विश्लेषण

समस्या विवरण
सहायक प्रजनन तकनीक (ART) में, नियंत्रित डिंबोत्सर्जन अतिउत्तेजना (COH) के दौरान प्राप्त होने वाले लगभग 15% ऊसाइट्स अपरिपक्व होते हैं, जो जर्मिनल वेसिकल (GV) या मेटाफेज I (MI) चरणों में मौजूद होते हैं। असामान्य भ्रूणीय विकास और पॉलीस्पर्मी (polyspermy) को रोकने में असमर्थता के कारणों से मानक नैदानिक अभ्यास में इन ऊसाइट्स को आमतौर पर त्याग दिया जाता है। हालांकि इन विट्रो परिपक्वता (IVM) के बाद इंट्रासाइटोप्लाज्मिक स्पर्म इंजेक्शन (ICSI) एक ज्ञात रणनीति है, लेकिन नियमित अल्पकालिक इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (IVF) के अधीन अपरिपक्व ऊसाइट्स के भाग्य के बारे में स्पष्टता का अभाव है। विशेष रूप से, यह अज्ञात है कि क्या ये ऊसाइट निषेचन कर सकते हैं, पॉलीस्पर्मी को रोकने के लिए आवश्यक कॉर्टिकल प्रतिक्रियाओं को सक्रिय कर सकते हैं, या व्यवहार्य ब्लास्टोसिस्ट (blastocysts) विकसित कर सकते हैं। इसके अलावा, ऐसे ऊसाइट्स से प्राप्त भ्रूणों की आनुवंशिक उत्पत्ति—चाहे वे सामान्य निषेचन, पार्टhenogenesis (parthenogenesis), या पॉलीस्पर्मी का परिणाम हों—विवादास्पद है। यह अध्ययन उन अपरिपक्व ऊसाइट्स की विकासात्मक क्षमता और आनुवंशिक सामग्री की जांच करने का लक्ष्य रखता है जो नियमित अल्पकालिक निषेचन के बाद ब्लास्टोसिस्ट के रूप में विकसित होते हैं।

कार्यप्रणाली
इस अध्ययन में फुजियान मेडिकल यूनिवर्सिटी के द्वितीय संबद्ध अस्पताल (2017-2022) के रोगियों को शामिल करते हुए एक पूर्वव्यापी विश्लेषण (retrospective analysis) और एक भविष्योन्मुखी आनुवंशिक जांच (prospective genetic investigation) का उपयोग किया गया।

1. पूर्वव्यापी कोहॉर्ट विश्लेषण: 1504 ART रोगियों के डेटा का विश्लेषण किया गया, जिसमें 5,957 भ्रूण शामिल थे जो ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचे। भ्रूण की गुणवत्ता का मूल्यांकन मानक रूपात्मक मानदंडों (कोशिका संख्या, विखंडन) और ब्लास्टोसिस्ट के लिए गार्डनर ग्रेडिंग प्रणाली का उपयोग करके किया गया। अपरिपक्व ऊसाइट्स (निषेचन के समय GV या MI के रूप में पहचाने गए) से प्राप्त ब्लास्टोसिस्ट की घटना की गणना की गई।
2. नमूना संग्रह और बायोप्सी: अपरिपक्व ऊसाइट्स (जो नियमित निषेचन के बाद आगे का विकास - प्रोन्यूक्लियस निर्माण या विदलन - प्रदर्शित करते थे) से प्राप्त नौ विशिष्ट भ्रूणों (नमूना C-1 से C-9) को चुना गया। इन ऊसाइट्स को निषेचन से पहले 2-4 घंटे और निषेचन के 4-6 घंटे बाद निर्वसन (denuded) किया गया। कोशिका द्रव्य (cytoplasmic cells) निकालने के लिए लेजर-असिस्टेड विधि का उपयोग करके तीसरे दिन (जाइगोट या विदलन चरण) पर बायोप्सी की गई।
3. आनुवंशिक विश्लेषण:
   • होल जीनोम एम्प्लीफिकेशन (WGA): बायोप्सी की गई कोशिकाओं पर MALBAC पद्धति का उपयोग करके सिंगल-सेल WGA किया गया।
   • नेक्स्ट-जेनरेशन सीक्वेंसिंग (NGS): प्लॉइडी स्थिति (ploidy status) निर्धारित करने और कॉपी नंबर विविधताओं (CNVs) का पता लगाने के लिए प्रवर्धित DNA का अनुक्रमण (sequencing) किया गया।
   • क्वांटिटेटिव पैरेंटल कंटैमिनेशन टेस्ट (qPCT): B एलील फ्रीक्वेंसी (BAF) का विश्लेषण करने के लिए इन्फिनियम एशियन स्क्रीनिंग ऐरे (ASA) का उपयोग करके जीनोटाइपिंग की गई। इस पद्धति ने पैरेंटल कंटैमिनेशन, एलीलिक एम्प्लीफिकेशन बायस और वास्तविक आनुवंशिक असामान्यताओं (जैसे मातृ एलोप्लोइडी) के बीच अंतर किया।
   • फ्लोरोसेंस इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (FISH): पांच नमूनों (E-1 से E-5) के एक अलग सेट पर सेक्स क्रोमोसोम की उपस्थिति की पुष्टि करने और स्पर्म प्रवेश की पुष्टि करने के लिए CEP X (हरा) और CEP Y (लाल) प्रोब का उपयोग करके FISH विश्लेषण किया गया।

मुख्य परिणाम

• विकासात्मक घटना: 5,957 ब्लास्टोसिस्ट में से 35 (0.59%) अपरिपक्व ऊसाइट्स से प्राप्त हुए थे। जबकि अपरिपक्व ऊसाइट्स के लिए तीसरे दिन उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूणों के निर्माण की दर (42.86%) परिपक्व ऊसाइट्स (72.49%) की तुलना में काफी कम थी, दोनों समूहों के बीच ब्लास्टोसिस्ट निर्माण दर (88.57% बनाम 89.4%) और परिणामी ब्लास्टोसिस्ट की गुणवत्ता में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था।
• आनुवंशिक संरचना:
  • मातृ एलोप्लोइडी (Maternal Alloploidy): आनुवंशिक अनुक्रमण ने खुलासा किया कि अधिकांश असामान्य प्रोन्यूक्लियस निर्माण (जैसे, बहु-प्रोन्यूक्लिआई) वाले भ्रूणों में पॉलीस्पर्मी के बजाय मातृ एलोप्लोइडी (मातृ हेटरोपलोइडी) प्रदर्शित हुई। यह सुझाव देता है कि क्रोमोसोमल असामान्यताएं पॉलीस्पर्मी के कारण नहीं, बल्कि ऊसाइट नाभिक के विषम परिपक्वता के कारण उत्पन्न होती हैं।
  • स्पर्म प्रवेश की पुष्टि: उच्च मातृ आनुवंशिक असामान्यताओं के बावजूद, अनुक्रमित किए गए चार भ्रूणों और FISH-विश्लेषण किए गए तीन भ्रूणों में Y क्रोमोसोम पाया गया। यह पुष्टि करता है कि स्पर्म सफलतापूर्वक अपरिपक्व ऊसाइट्स में प्रवेश कर गए और आनुवंशिक योगदान दिया, जिससे इन मामलों के लिए शुद्ध पार्टhenogenesis की संभावना खारिज हो गई।
  • प्रोन्यूक्लियस असामान्यताएं: असामान्य प्रोन्यूक्लियस जाइगोट (जैसे, >3PN) की उच्च घटना देखी गई। हालांकि, अध्ययन ने नोट किया कि असामान्य प्रोन्यूक्लियस आकारिकी का हमेशा असामान्य आनुवंशिक सामग्री के साथ सहसंबंध नहीं होता है; कुछ 2PN भ्रूण मातृ एलोप्लोइड पाए गए।
• FISH सत्यापन: FISH विश्लेषण ने अनुक्रमण डेटा की पुष्टि की, जिसमें अपरिपक्व ऊसाइट्स से विकसित हुए भ्रूणों में Y क्रोमोसोम का पता चला, जो यह समर्थन करता है कि निषेचन हुआ था।

मुख्य योगदान

• दुर्लभ घटनाओं का परिमाणीकरण: अध्ययन नियमित IVF के माध्यम से ब्लास्टोसिस्ट विकसित होने वाले अपरिपक्व ऊसाइट्स की घटना (0.59%) को मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है, जो अक्सर नैदानिक त्याग प्रोटोकॉल में अनदेखा किया जाता है।
• यांत्रिक अंतर्दृष्टि: qPCT और FISH का उपयोग करके, अध्ययन अपरिपक्व ऊसाइट-व्युत्पन्न भ्रूणों में मातृ एलोप्लोइडी और पॉलीस्पर्मी के बीच अंतर करता है। यह तर्क देता है कि देखी गई क्रोमोसोमल असामान्यताएं पॉलीस्पर्मी को रोकने के लिए कॉर्टिकल रिएक्शन की विफलता के बजाय अपूर्ण अर्धसूत्रीविभाजन (meiosis) और नाभिकीय अपरिपक्वता के कारण होने की संभावना है।
• निषेचन का सत्यापन: इन भ्रूणों में पैतृक आनुवंशिक सामग्री (Y क्रोमोसोम) का पता चलना यह पुष्टि करता है कि अपरिपक्व ऊसाइट्स निषेचन कर सकते हैं और स्पर्म विकास के लिए आवश्यक शारीरिक प्रक्रियाओं को सक्रिय कर सकते हैं, भले ही नाभिकीय परिपक्वता विषम (asynchronous) हो।

महत्व और दावे
लेखक निष्कर्ष निकालते हैं कि अपरिपक्व ऊसाइट्स में एक प्रकार की विकासात्मक क्षमता होती है जो उन्हें नियमित अल्पकालिक निषेचन के बाद ब्लास्टोसिस्ट बनाने की अनुमति देती है, हालांकि इसकी घटना बहुत कम है। एक बार ब्लास्टोसिस्ट बन जाने के बाद, इसकी रूपात्मक गुणवत्ता परिपक्व ऊसाइट-व्युत्पन्न भ्रूणों के समान होती है।

शोध का दावा है कि:

1. इन भ्रूणों में असामान्य प्रोन्यूक्लियस निर्माण पारंपरिक अर्थों में पॉलीस्पर्मी की तरह असामान्य आनुवंशिक सामग्री का संकेत नहीं देता है, बल्कि मातृ नाभिकीय अपरिपक्वता को दर्शाता है।
2. स्पर्म अपरिपक्व ऊसाइट्स में प्रवेश कर सकते हैं, और निषेचन प्रक्रिया आगे बढ़ सकती है, जो यह सुझाव देता है कि कॉर्टिकल रिएक्शन और Na+ इन्फ्लक्स तंत्र अभी भी कुछ हद तक कार्य कर सकते हैं।
3. इन भ्रूणों की नैदानिक उपयोगिता पर आगे जांच की आवश्यकता है, क्योंकि वे ART के लिए एक संभावित, हालांकि सीमित, स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।
4. ये निष्कर्ष अपरिपक्वता के संदर्भ में कॉर्टिकल रिएक्शन और निषेचन के तंत्रों में आगे के शोध के लिए आधार प्रदान करते हैं।

अध्ययन एक संतुलित स्वर बनाए रखता है, यह स्वीकार करते हुए कि हालांकि ये भ्रूण विकसित हो सकते हैं, उच्च स्तर की आनुवंशिक असामान्यताएं (मातृ एलोप्लोइडी) वर्तमान में उनके तत्काल नैदानिक अनुप्रयोग को सीमित करती हैं, और उनके विकास को नियंत्रित करने वाले सटीक तंत्रों को और अधिक स्पष्ट करने की आवश्यकता है।