Analysis of the genetic material of immature oocytes derived embryos after short-term insemination in vitro

技术摘要：短期体外授精后由未成熟卵母细胞发育而成的胚胎遗传物质分析

问题陈述
在辅助生殖技术（ART）中，受控促排卵（COH）过程中回收的卵母细胞中，约有1 ability 5% 是未成熟的，处于生发泡（GV）或减数分裂 I（MI）阶段。标准的临床实践通常会丢弃这些卵母细胞，因为担心其会导致胚胎发育异常以及无法防止多精受精。虽然体外成熟（IVM）结合卵胞质内单精子注射（ICSI）是一种已知的策略，但接受常规短期体外受精（IVF）的未成熟卵母细胞的命运仍不明确。具体而言，目前尚不清楚这些卵母细胞是否能够完成受精、触发必要的皮层反应以防止多精受精，以及能否发育为具有活力的囊胚。此外，这类胚胎的遗传来源——是源于正常受精、孤雌妊娠还是多精受精——仍存在争议。本研究旨在调查在常规短期授精后发育为囊胚的未成熟卵母细胞的发育潜力和遗传物质。

研究方法
本研究采用了回顾性分析和前瞻性遗传学调查，研究对象来自福建医科大学第二附属医院的患者（2017–2022年）。

1. 回顾性队列分析： 分析了 1504 名 ART 患者的数据，涵盖了 5,957 个发育至囊胚阶段的胚胎。通过标准形态学标准（细胞数量、碎片率）和 Gardner 囊胚分级系统对胚胎质量进行评估。计算了由未成熟卵母细胞（授精时鉴定为 GV 或 MI 阶段）发育而成的囊胚发生率。
2. 样本采集与活检： 选取了 9 个特定的胚胎（样本 C-1 至 C-9），这些胚胎源自经过常规短期授精后显示出进一步发育（原核形成或分裂）的未成熟卵母细胞。这些卵母细胞在授精前培养 2–4 小时，并在授精后 4–6 小时进行去透明质化处理。在第 3 天（受精卵或分裂阶段）使用激光辅助方法进行活检，以提取细胞质细胞。
3. 遗传学分析：
   • 全基因组扩增（WGA）： 使用 MALBAC 方法对活检细胞进行单细胞 WGA。
   • 二代测序（NGS）： 对扩增后的 DNA 进行测序，以确定倍性状态并检测拷贝数变异（CNVs）。
   • 定量亲本污染测试（qPCT）： 使用 Infinium Asian Screening Array (ASA) 进行基因型分析，通过分析 B 等位基因频率（BAF）来区分亲本污染、等位基因扩增偏差和真实的遗传异常（如母体异倍体）。
   • 荧光原位杂交（FISH）： 另一组 5 个样本（E-1 至 E-5）接受了使用 CEP X（绿色）和 CEP Y（红色）探针的 FISH 分析，以验证性染色体的存在并确认精子进入。

关键结果

• 发育发生率： 在 5,957 个囊胚中，有 35 个（0.59%）源自未成熟卵母细胞。虽然未成熟卵母细胞在第 3 天形成高质量胚胎的比例显著低于成熟卵母细胞（42.86% vs. 72.49%），但两组之间的囊胚形成率（88.57% vs. 89.4%）及所得囊胚的质量并无统计学差异。
• 遗传组成：
  • 母体异倍体： 基因测序显示，大多数出现异常原核形成（如多原核）的胚胎表现为母体异倍体（母体非整倍体）而非多精受精。这表明染色体异常源于卵母细胞核的异步成熟，而非多个精子的进入。
  • 精子进入确认： 尽管母体遗传异常率较高，但在测序的胚胎中有 4 个、FISH 分析的胚胎中有 3 个检测到了 Y 染色体。这证实了精子成功进入了未成熟卵母细胞并贡献了遗传物质，从而排除了这些病例属于纯粹孤雌妊娠的可能性。
  • 原核异常： 观察到高比例的异常原核受精卵（如 >3PN）。然而，研究指出异常的原核形态并不总是与异常的遗传物质相关；一些 2PN 胚胎也被发现是母体异倍体。
• FISH 验证： FISH 分析证实了测序数据，在由未成熟卵母细胞发育而成的胚胎中检测到了 Y 染色体，进一步支持了受精发生的结论。

主要贡献

• 量化罕见事件： 本研究提供了经验数据，量化了通过常规 IVF 发育为囊胚的未成熟卵母细胞的发生率（0.59%），这一现象在临床丢弃方案中常被忽视。
• 机制洞察： 通过利用 qPCT 和 FISH，本研究区分了由未成熟卵母细胞衍生胚胎中的母体异倍体与多精受精。研究认为，观察到的染色体异常很可能是由于卵母细胞的不完全减数分裂和核成熟度不足，而非由于未能通过皮层反应阻断多精受精。
• 受精验证： 在这些胚胎中检测到父系遗传物质（Y 染色体），证实了未成熟卵母细胞可以完成受精，且精子可以触发发育所需的生理过程，即使在核成熟异步的情况下也是如此。

意义与主张
作者得出结论，未成熟卵母细胞具有一定程度的发育潜力，使其在经过常规短期授精后能够形成囊胚，尽管发生率较低。一旦形成囊胚，其形态质量与成熟卵母细胞来源的胚胎相当。

本文主张：

1. 这些胚胎中异常的原核形成并不一定意味着传统意义上的遗传异常（如多精受精），而是反映了母体核成熟度不足。
2. 精子可以进入未成熟卵母细胞并完成受精过程，这表明皮层反应和 Na+ 内流机制在一定程度上仍能发挥作用。
3. 这些胚胎的临床应用价值值得进一步研究，因为它们可能代表了 ART 中一个潜在但有限的胚胎来源。
4. 这些发现为进一步研究卵母细胞不成熟背景下的皮层反应和受精机制提供了基础。

研究保持了审慎的基调，承认虽然这些胚胎可以发育，但由于高比例的遗传异常（母体异倍体），目前限制了它们的直接临床应用，且其发育的精确机制仍需进一步阐明。