Specific detection of RHDV2 by the RT-RPA-CRISPR/Cas14a1 system

खरगोशों को अक्सर सौम्य और शांत जीव माना जाता है, लेकिन वे 'रैबिट हेमोरेजिक डिजीज' (rabbit hemorrhagic disease) नामक एक भयानक बीमारी के प्रति बेहद संवेदनशील होते हैं। यह बीमारी, एक ऐसे वायरस के कारण होती है जो यकृत (लीवर) और अन्य अंगों पर हमला करता है, और यह अत्यंत तीव्र गति से फैलती है, जिससे संक्रमित जानवरों की कुछ ही घंटों में मृत्यु हो जाती है। दशकों से, किसान और वन्यजीव जीवविज्ञानी इस वायरस की पहचान करने के लिए प्रयोगशाला परीक्षणों पर निर्भर रहे हैं, लेकिन इन विधियों के लिए आमतौर पर महंगी मशीनों, विशेष प्रशिक्षण और एक नियंत्रित वातावरण की आवश्यकता होती है। यह एक महत्वपूर्ण अंतर पैदा करता है: जब तक नमूना किसी दूर स्थित लैब तक पहुँचता है, तब तक प्रकोप पहले ही फैल चुका होता है। हाल ही में, इस वायरस का एक नया और अधिक खतरनाक संस्करण, जिसे RHDV2 कहा जाता है, उभरा है। अपने पूर्ववर्तियों के विपरीत, यह वेरिएंट सभी उम्र के खरगोशों को संक्रमित कर सकता है, जिसमें बहुत छोटे बच्चे (किट्स) भी शामिल हैं, और यह दुनिया भर में फैल गया है, जिससे पालतू फार्म और जंगली आबादी दोनों के लिए खतरा पैदा हो गया है। तत्काल आवश्यकता एक ऐसे तरीके की है जिससे इस वायरस का पता वहीं लगाया जा सके जहाँ जानवर मौजूद हैं, बिना किसी केंद्रीय प्रयोगशाला की प्रतीक्षा किए।

इस चुनौती से निपटने के लिए, सिचुआन कृषि विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक नई परीक्षण विधि विकसित की है जो दो शक्तिशाली जैविक उपकरणों को जोड़ती है। पहला उपकरण 'रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन रीकॉम्बिनेज पॉलीमरेज एम्प्लीफिकेशन' (RT-RPA) नामक एक तकनीक है। इसे एक 'आणविक फोटोकॉपी मशीन' के रूप में समझें जो केवल कुछ ही मिनटों में वायरल जेनेटिक मटेरियल के एक विशिष्ट हिस्से की लाखों प्रतियां बना सकती है, जिसके लिए जटिल मशीन के बजाय केवल एक साधारण ताप स्रोत की आवश्यकता होती है। दूसरा उपकरण CRISPR सिस्टम का एक घटक है, विशेष रूप से Cas14a1 नामक एक प्रोटीन। प्रकृति में, यह प्रोटीन बैक्टीरिया के लिए एक सुरक्षा गार्ड के रूप में कार्य करता है, जो घुसपैठ करने वाले जेनेटिक मटेरियल की जांच करता है। जब इसे कोई मेल मिलता है, तो यह लक्ष्य को तोड़ देता है और एक अनोखे मोड़ के साथ, आस-पास के किसी भी सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणुओं को बेतरतीब ढंग से काटना शुरू कर देता है। शोधकर्ताओं ने इस व्यवहार का उपयोग एक छोटे डीएनए स्ट्रैंड से जुड़े फ्लोरोसेंट टैग के माध्यम से किया। यदि वायरस मौजूद है, तो Cas14a1 प्रोटीन सक्रिय हो जाता है, लक्ष्य को काटता है, और फिर टैग किए गए डीएनए को काटने लगता है, जिससे एक चमकदार चमक निकलती है जिसे विशेष प्रकाश के नीचे नग्न आंखों से देखा जा सकता है।

शोधकर्ताओं ने RHDV2 वायरस जीनोम के एक विशिष्ट, स्थिर क्षेत्र की पहचान करके शुरुआत की, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उनका परीक्षण अन्य सामान्य खरगोश रोगजनकों (पैथोजन्स) को वायरस न समझ ले। उन्होंने प्राइमर्स (primers) का एक सेट तैयार किया, जो छोटे डीएनए अनुक्रम हैं जो आणविक फोटोकॉपी मशीन को सही स्थान पर निर्देशित करते हैं, और एक गाइड आरएनए (guide RNA) भी बनाया जो Cas14a1 प्रोटीन को निर्देशित करे। लैब में Cas14a1 प्रोटीन को सावधानीपूर्वक उगाने और शुद्ध करने के बाद, उन्होंने प्रतिक्रिया के लिए विभिन्न सामग्रियों और तापमानों के संयोजन का परीक्षण किया ताकि सटीक 'नुस्खा' खोजा जा सके। उन्होंने पाया कि यह प्रणाली 44 डिग्री सेल्सियस के गर्म तापमान पर सबसे अच्छा काम करती है, जो परिष्कृत थर्मल साइक्लर्स के बजाय साधारण हीटिंग ब्लॉक्स के माध्यम से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।

एक बार प्रणाली अनुकूलित (optimized) हो जाने के बाद, टीम ने इसे परीक्षण के लिए रखा। उन्होंने इस विधि को वायरस सहित विभिन्न प्रकार के नमूनों, जैसे कि रोटावायरस, पेस्ट्यूरेला और साल्मोनेला जैसे अन्य सामान्य खरगोश रोगों के साथ चुनौती दी। परिणाम स्पष्ट थे: सिस्टम केवल तभी चमकीला हुआ जब RHDV2 मौजूद था, और अन्य रोगजनकों के प्रति कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखाई। इससे पुष्टि हुई कि यह परीक्षण अत्यधिक विशिष्ट है और इससे गलत अलार्म (false alarms) उत्पन्न नहीं होंगे। इसके बाद, उन्होंने परीक्षण की संवेदनशीलता को मापा। उन्होंने पाया कि यह प्रणाली प्रति माइक्रोलीटर तरल पदार्थ में वायरस की मात्र 45.9 प्रतियों का पता लगा सकती है। संवेदनशीलता का यह स्तर वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले सबसे उन्नत प्रयोगशाला परीक्षणों के बराबर है, फिर भी इसे बहुत सरल सेटअप के साथ हासिल किया गया है।

यह देखने के लिए कि क्या यह विधि वास्तविक दुनिया में काम करेगी, शोधकर्ताओं ने खरगोशों के तीस वास्तविक ऊतक नमूनों (tissue samples) पर इसका परीक्षण किया, जिनमें से कुछ बीमार थे और कुछ स्वस्थ। उन्होंने अपनी नई विधि की तुलना 'गोल्ड स्टैंडर्ड' प्रयोगशाला तकनीक, जिसे RT-qPCR कहा जाता है, से की। परिणाम पूरी तरह से मेल खाते थे; नए सिस्टम ने मानक लैब परीक्षण की तरह ही सात सकारात्मक मामलों और तेईस नकारात्मक मामलों की पहचान की। यह पूर्ण सहमति दर्शाती है कि यह विधि फील्ड में बीमार जानवरों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने हेतु पर्याप्त विश्वसनीय है। परिणाम की दृश्य प्रकृति, जहाँ एक साधारण नीला या पराबैंगनी (ultraviolet) प्रकाश चमकते संकेत को प्रकट करता है, का अर्थ है कि किसी भी जटिल उपकरण के बिना सकारात्मक परिणाम की पुष्टि की जा सकती है।

हालांकि यह अध्ययन तेजी से निदान के लिए एक अत्यधिक आशाजनक उपकरण का प्रदर्शन करता है, शोधकर्ता नोट करते हैं कि इसे व्यापक रूप से फील्ड में तैनात करने से पहले आगे के काम की आवश्यकता है। ऐसे मुद्दों जैसे कि ऑन-साइट नमूनों को कैसे तैयार किया जाए, बिना रेफ्रिजरेशन के अभिकर्मकों (reagents) को कैसे स्टोर किया जाए, और परिणामों को पढ़ने के लिए पोर्टेबल उपकरणों का विकास अभी भी ध्यान देने योग्य विषय हैं। हालांकि, मुख्य उपलब्धि महत्वपूर्ण है: उन्होंने एक ऐसी प्रणाली बनाई है जो उन्नत आणविक पहचान की शक्ति को उस स्तर तक ले आती है जहाँ इसका उपयोग जल्दी और आसानी से किया जा सके। उन किसानों और वन्यजीव प्रबंधकों के लिए जो RHDV2 के प्रसार का सामना कर रहे हैं, यह जवाबों की प्रतीक्षा करने के बजाय लगभग तुरंत उन्हें अपने हाथ में होने की ओर एक संभावित बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे खरगोशों की आबादी की रक्षा के लिए तेजी से निर्णय लेना संभव हो सकेगा।