Specific detection of RHDV2 by the RT-RPA-CRISPR/Cas14a1 system

Konijnen worden vaak gezien als zachte, stille wezens, maar ze zijn kwetsbaar voor een angstaanjagende ziekte die bekend staat als het konijnenhemorrhagisch viraal hemorragisch ziektecomplex. Deze ziekte, veroorzaakt door een virus dat de lever en andere organen aanvalt, verspreidt zich met angstwekkende snelheid en doodt geïnfecteerde dieren binnen enkele uren. Decennialang hebben boeren en wildlife-biologen vertrouwd op laboratoriumtests om het virus te identificeren, maar deze methoden vereisen meestal dure machines, gespecialiseerde training en een gecontroleerde omgeving. Dit creëert een aanzienlijke kloof: tegen de tijd dat een monster een verafgelegen laboratorium bereikt, kan de uitbraak al verspreid zijn. Onlangs is er een nieuwe en gevaarlijkere versie van dit virus opgekomen, genaamd RHDV2. In tegenstelling tot zijn voorgangers kan deze variant konijnen van alle leeftijden infecteren, inclusief zeer jonge jongen, en heeft het zich wereldwijd verspreid, wat zowel tamme veestapels als wilde populaties bedreigt. De dringende behoefte is aan een manier om dit virus snel en nauwkeurig te detecteren op de plek waar de dieren zich bevinden, zonder te hoeven wachten op een centraal laboratorium.

Om deze uitdaging aan te gaan, heeft een team onderzoekers van de Sichuan Agricultural University een nieuwe testmethode ontwikkeld die twee krachtige biologische hulpmiddelen combineert. Het eerste hulpmiddel is een techniek genaamd reverse-transcription recombinase polymerase amplification, of RT-RPA. Zie dit als een moleculaire fotokopieermachine die in enkele minuten miljoenen kopieën kan maken van een specifiek stukje viraal genetisch materiaal, met behulp van slechts een eenvoudige warmtebron in plaats van een complex apparaat. Het tweede hulpmiddel is een component van het CRISPR-systeem, specifiek een eiwit genaamd Cas14a1. In de natuur fungeert dit eiwit als een beveiligingsbeambte voor bacteriën, die scant op binnendringend genetisch materiaal. Wanneer het een match vindt, scheurt het de doelwitstructuur uiteen en, in een unieke wending, begint het willekeurig nabijgelegen enkelstrengs DNA-moleculen door te snijden. De onderzoekers hebben dit gedrag benut door een fluorescerende tag aan een kleine DNA-streng te bevestigen. Als het virus aanwezig is, wordt het Cas14a1-eiwit geactiveerd, snijdt het doelwit door, en gaat vervolgens over tot het doorsnijden van het getagde DNA, waardoor een heldere gloed vrijkomt die met het blote oog zichtbaar is onder een speciale lamp.

De onderzoekers begonnen met het identificeren van een specifieke, stabiele regio in het genoom van het RHDV2-virus om te targeten, om ervoor te zorgen dat hun test het virus niet zou verwarren met andere veelvoorkomende pathogenen bij konijnen. Ze ontwierpen een set primers, wat korte DNA-sequenties zijn die de moleculaire fotokopieermachine naar de juiste plek leiden, en een gids-RNA om het Cas14a1-eiwit te sturen. Na het zorgvuldig kweken en zuiveren van het Cas14a1-eiwit in het laboratorium, testten ze verschillende combinaties van ingrediënten en temperaturen om het perfecte recept voor de reactie te vinden. Ze ontdekten dat het systeem het beste werkte bij een warme temperatuur van 44 graden Celsius, een bereik dat gemakkelijk te bereiken is met eenvoudige verwarmingsblokken in plaats van geavanceerde thermische cyclers.

Zod eens het systeem geoptimaliseerd was, onderwierp het team het aan de test. Ze daagden de methode uit met een breed scala aan monsters, inclus van het virus zelf en andere veelvoorkomende konijnenziekten zoals rotavirus, pasteurella en salmonella. De resultaten waren duidelijk: het systeem lichtte alleen helder op wanneer RHDV2 aanwezig was, en vertoonde geen reactie op de andere pathogenen. Dit bevestigde dat de test zeer specifiek is en geen valse alarmen zal geven. Vervolgens maten ze hoe gevoelig de test was. Ze ontdekten dat het systeem zelfs slechts 45,9 kopieën van het virus per microliter vloeistof kon detecteren. Dit niveau van gevoeligheid is vergelijkbaar met de meest geavanceerde laboratoriumtests die momenteel in gebruik zijn, terwijl het met een veel eenvoudigere opstelling werd bereikt.

Om te zien of de methode in de echte wereld zou werken, testten de onderzoekers het op dertig werkelijke weefselmonsters van konijnen, waarvan sommige bekend waren als ziek en andere gezond. Ze vergeleken hun nieuwe methode met de gouden standaard, een laboratoriumtechniek genaamd RT-qPCR. De resultaten waren perfect in lijn; het nieuwe systeem identificeerde dezelfde zeven positieve gevallen en drieentwintig negatieve gevallen als de standaard laboratoriumtest. Deze perfecte overeenstemming suggereert dat de methode betrouwbaar genoeg is om te worden gebruikt voor het screenen van zieke dieren in het veld. Het visuele karakter van het resultaat, waarbij een eenvoudig blauw of ultraviolet licht een gloeiend signaal onthult, betekent dat een positief resultaat kan worden bevestigd zonder enig complex apparaat.

Hoewel de studie een zeer veelbelovend instrument demonstreert voor snelle diagnose, merken de onderzoekers op dat er nog verdere arbeid nodig is voordat het breed in het veld kan worden ingezet. Problemen zoals het voorbereiden van de monsters ter plaatse, het opslaan van de reagentia zonder koeling en de ontwikkeling van draagbare apparaten voor het aflezen van de resultaten vereisen nog steeds aandacht. De kernprestatie is echter aanzienlijk: ze hebben een systeem gecreëerd dat de kracht van geavanceerde moleculaire detectie naar een niveau brengt waar het snel en gemakkelijk kan worden gebruikt. Voor boeren en natuurbeheerders die geconfronteerd worden met de verspreiding van RHDV2, vertegenwoordigt dit een potentiële verschuiving van het wachten op antwoorden naar het bijna onmiddellijk in handen hebben ervan, waardoor snellere beslissingen kunnen worden genomen om konijnenpopulaties te beschermen.