Rewiring the PEP-pyruvate-oxaloacetate node through coordinated fine- tuning of gltA and pykF expression for L-threonine production in wild-type Escherichia coli
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि प्रतिस्पर्धी मार्गों को हटाने के बजाय, PEP-पायरूवेट-ऑक्सलोएसीटेट नोड पर कार्बन प्रवाह को पुनर्संतुलित करने के लिए *gltA* और *pykF* की अभिव्यक्ति को समन्वित रूप से फाइन-ट्यून करना, एक प्लास्मिड-मुक्त वाइल्ड-टाइप *E. coli* स्ट्रेन को प्रेरकों या एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता के बिना उच्च-स्तरीय L-थ्रोनिन उत्पादन (एक बायोरिएक्टर में 101.6 g/L) प्राप्त करने में सक्षम बनाता है।
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जीवन शरीर बनाने और उसे ईंधन देने के बीच एक नाजुक संतुलन पर निर्भर करता है। बैक्टीरिया की सूक्ष्म दुनिया में, यह संतुलन एक केंद्रीय केंद्र द्वारा प्रबंधित किया जाता है जहाँ कार्बन, जो जीवन का मौलिक निर्माण खंड है, को विभिन्न मार्गों में विभाजित किया जाता है। इस कार्बन का कुछ हिस्सा ऊर्जा बनाने के लिए जलाया जाता है, जबकि बाकी को अमीनो एसिड जैसे आवश्यक अणुओं के निर्माण के लिए बचाया जाता है, जो प्रोटीन के लिए कच्चे माल के रूप में कार्य करते हैं। ऐसा ही एक अमीनो एसिड, एल-थ्रोनिन (L-threonine), मनुष्यों और कई जानवरों के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि हमारा शरीर इसे नहीं बना सकता; हमें इसे अपने भोजन से प्राप्त करना पड़ता है। इसी कारण से, वैज्ञानिकों ने लंबे समय से बैक्टीरिया को एल-थ्रोनिन का बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए इंजीनियर करने का प्रयास किया है ताकि इसका उपयोग पशु आहार और पूरक (सप्लीमेंट्स) में किया जा सके। चुनौती हमेशा बैक्टीरिया को जीवित रहने और बढ़ने के लिए आवश्यक ऊर्जा से भूखा रखे बिना, इस अमीनो एसिड का अधिक उत्पादन करने का तरीका खोजने की रही है। यदि कारखाना उत्पाद बनाने के लिए बहुत अधिक मेहनत करता है, तो श्रमिक—यानी बैक्टीरिया—ढह जाते हैं। यदि वे बढ़ने पर बहुत अधिक ध्यान केंद्रित करते हैं, तो उत्पाद कभी प्रकट नहीं होता।
वर्षों तक, इस समस्या को हल करने का मानक दृष्टिकोण बैक्टीरिया के चयापचय (मेटाबॉलिज्म) पर हथौड़े से प्रहार करने जैसा था। शोधकर्ता केवल उन जीनों को हटा देते थे जो प्रतिस्पर्धी मार्गों के लिए जिम्मेदार होते थे, जिससे एल-थ्रोनिन की ओर सारा कार्बन मोड़ने के लिए ऊर्जा मार्गों को प्रभावी रूप से काट दिया जाता था। हालाँकि, इस बलपूर्वक प्रहार के अक्सर प्रतिकूल परिणाम मिलते थे। इन प्रतिस्पर्धी मार्गों को पूरी तरह से हटाकर, बैक्टीरिया अपनी ऊर्जा कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने की क्षमता खो देते थे, जिससे उनकी वृद्धि खराब हो जाती थी और पैदावार कम हो जाती थी। ग्वांगडोंग, चीन के इंस्टीट्यूट ऑफ माइक्रोबायोलॉजी के शोधकर्ताओं के एक नए अध्ययन से पता चलता है कि एक अधिक सूक्ष्म, समन्वित दृष्टिकोण कहीं बेहतर काम करता है। प्रतिस्पर्धी मार्गों को पूरी तरह से हटाने के बजाय, उन्होंने उन्हें सूक्ष्मता से नियंत्रित करना सीखा, जैसे एक कुशल कंडक्टर वाद्ययंत्रों को चुप कराने के बजाय एक ऑर्केस्ट्रा का प्रबंधन करता है।
शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया की कोशिका में एक विशिष्ट जंक्शन पर ध्यान केंद्रित किया जिसे PEP-पायरूवेट-ऑक्सालोएसीटेट नोड के रूप में जाना जाता है। इस नोड की कल्पना एक व्यस्त चौराहे के रूप में करें जहाँ कार्बन अणुओं की एक धारा को दो मुख्य सड़कों में से एक को चुनना होता है: एक ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र की ओर ले जाता है, जो कोशिका को बढ़ने के लिए ऊर्जा उत्पन्न करने की एक प्रक्रिया है, और दूसरा एल-थ्रोनिन के उत्पादन की ओर ले जाता है। एक मानक बैक्टीरिया कोशिका में, अधिकांश कार्बन स्वाभाविक रूप से ऊर्जा उत्पादन की ओर बहता है, जिससे अमीनो एसिड बनाने के लिए बहुत कम बचता है। इस चौराहे पर ट्रैफिक कंट्रोलर के रूप में कार्य करने वाले दो मुख्य एंजाइम साइट्रेट सिंथेज़ (citrate synthase) और पाइरूवेट किनसे (pyruvate kinase) हैं। पिछले प्रयासों में, वैज्ञानिकों ने ऊर्जा मार्ग को अवरुद्ध करने के लिए इन एंजाइमों को पूरी तरह से हटाने की कोशिश की थी, लेकिन इससे बैक्टीरिया की कोशिकाएं बढ़ना भी बंद कर देती थीं और एल-थ्रोनिन का उत्पादन भी रुक जाता था।
टीम को एहसास हुआ कि समस्या इन मार्गों का अस्तित्व नहीं था, बल्कि उनकी गतिविधि का समय था। उन्हें एक ऐसा तरीका चाहिए था जिससे वे पहले बैक्टीरिया को बढ़ने दें, ऊर्जा मार्गों का उपयोग करके, और फिर जनसंख्या पर्याप्त बड़ी होने के बाद प्रवाह को अमीनो एसिड उत्पादन की ओर मोड़ सकें। इसे प्राप्त करने के लिए, उन्होंने ट्रैफिक कंट्रोलरों के जीनों को हटाया नहीं। इसके बजाय, उन्होंने उन जेनेटिक स्विचों को फिर से व्यवस्थित किया जो इन जीनों को चालू और बंद करते हैं। उन्होंने विशेष प्रमोटरों (promoters) का उपयोग किया—जेनेटिक अनुक्रम जो सेंसर की तरह कार्य करते हैं—जो बैक्टीरिया के विकास चरण का पता लगाते हैं। विकास के शुरुआती, तीव्र चरण के दौरान, इन सेंसरों ने ऊर्जा मार्गों को पूरी तरह से खुला रखा, जिससे बैक्टीरिया को एक मजबूत आबादी बनाने में मदद मिली। एक बार जब बैक्टीरिया एक धीमी, स्थिर अवस्था में प्रवेश कर गया जहाँ विकास स्वाभाविक रूप से धीमा हो जाता है, तो सेंसरों ने ऊर्जा मार्गों की गतिविधि को स्वचालित रूप से कम कर दिया। इस सूक्ष्म बदलाव ने उस अतिरिक्त कार्बन को, जिसकी अब विकास के लिए आवश्यकता नहीं थी, सीधे एल-थ्रोनिन उत्पादन लाइन की ओर पुनर्निर्देशित कर दिया।
इस प्रणाली को और भी अधिक कुशल बनाने के लिए, शोधकर्ताओं ने इस गतिशील स्विच को अन्य सुधारों के साथ जोड़ा। उन्होंने कच्चे माल को अंतिम अमीनो एसिड में बदलने वाले रासायनिक श्रृंखला के विशिष्ट चरणों को मजबूत किया और यह सुनिश्चित किया कि बैक्टीरिया उत्पाद को कोशिका से बाहर जल्दी निर्यात कर सके। उन्होंने एक प्रमुख प्रिकर्सर (precursor) अणु की आपूर्ति को भी समायोजित किया ताकि उत्पादन लाइन कभी खाली न रहे। महत्वपूर्ण रूप से, उन्होंने इन सभी जेनेटिक परिवर्तनों को बैक्टीरिया के मुख्य गुणसूत्र (क्रोमोसोम) में सीधे स्थानांतरित कर दिया, बजाय इसके कि उन्हें डीएनए के छोटे, अस्थिर छल्लों यानी प्लास्मिड पर छोड़ा जाए। इसने इस नए स्ट्रेन को स्थिर बनाया और सिस्टम को चलाने के लिए एंटीबायोटिक या रासायनिक ट्रिगर्स की आवश्यकता को समाप्त कर दिया, जो औद्योगिक उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ है।
इन समन्वित सूक्ष्म ट्यूनिंग के परिणाम आश्चर्यजनक थे। एक साधारण प्रयोगशाला फ्लास्क में, इंजीनियर किए गए बैक्टीरिया ने प्रति लीटर तरल में 28.3 ग्राम एल-थ्रोनिन का उत्पादन किया। यह नियंत्रण स्ट्रेन (control strain) की तुलना में एक विशाल सुधार था, जिसने लगभग कुछ भी उत्पादित नहीं किया था। जब शोधकर्ताओं ने औद्योगिक स्थितियों का अनुकरण करते हुए एक बड़े बायोरिएक्टर में इस प्रक्रिया को स्थानांतरित किया, तो बैक्टीरिया ने 101.6 ग्राम प्रति लीटर का उत्पादन किया। यह प्रक्रिया अत्यधिक कुशल थी, जिसने बैक्टीरिया को खिलाए गए ग्लूकोज शुगर के लगभग 64 प्रतिशत को अमीनो एसिड में परिवर्तित किया। शायद सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि बैक्टीरिया प्रारंभिक चरण के दौरान सामान्य कोशिकाओं की तरह ही अच्छी तरह से बढ़े, जिससे यह सिद्ध हुआ कि रणनीति ने विकास और उत्पादन की जरूरतों के बीच सफलतापूर्वक संतुलन बनाए रखा।
यह अध्ययन दर्शाता है कि मेटाबोलिक इंजीनियरिंग में, बल के बजाय सटीकता अक्सर जीतती है। बैक्टीरिया के विकास की प्राकृतिक लय को समझकर और एक ऐसी प्रणाली डिजाइन करके जो उन लय का सम्मान करती है, शोधकर्ता कोशिकाओं को अत्यधिक कुशल कारखाने बनाने के लिए प्रेरित करने में सफल रहे। उन्होंने दिखाया कि प्रतिस्पर्धी मार्गों को उपयोगी होने के लिए नष्ट करने की आवश्यकता नहीं है; उन्हें बस प्रबंधित करने की आवश्यकता है। सूक्ष्म ट्यूनिंग (fine-tuning) का यह दृष्टिकोण, हटाने के बजाय, अन्य आवश्यक अमीनो एसिड और जटिल रसायनों के उत्पादन के लिए एक ब्लूप्रिंट के रूप में कार्य कर सकता है, जो सूक्ष्मजीवी जीवन की शक्ति का उपयोग करने का एक अधिक टिकाऊ और प्रभावी तरीका प्रदान करता है।
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