Rewiring the PEP-pyruvate-oxaloacetate node through coordinated fine- tuning of gltA and pykF expression for L-threonine production in wild-type Escherichia coli

Het leven hangt af van een delicate balans tussen het opbouwen van een lichaam en het voeden ervan. In de microscopische wereld van bacteriën wordt deze balans beheerd door een centraal knooppunt waar koolstof, de fundamentele bouwsteen van het leven, in verschillende routes wordt gesorteerd. Een deel van deze koolstof wordt verbrand om energie te creëren, terwijl de rest wordt bewaard voor de constructie van essentiële moleculen zoals aminozuren, de grondstoffen voor eiwitten. Een zodanig aminozuur, L-threonine, is van vitaal belang voor mensen en veel dieren omdat ons lichaam het niet zelf kan aanmaken; we moeten het uit ons voedsel halen. Vanwege dit feit hebben wetenschappers lang geprobeerd bacteriën zo te manipuleren dat ze grote hoeveelheden L-threonine produceren voor gebruik in veevoer en supplementen. De uitdaging is altijd geweest om een manier te vinden om de bacteriën meer van dit aminozuur te laten produceren zonder de cellen uit te hongeren van de energie die ze nodig hebben om te overleven en te groeien. Als de fabriek te hard werkt aan het maken van het product, bezwijken de arbeiders — de bacteriën. Als ze zich te veel richten op groei, verschijnt het product nooit.

Jarenlang was de standaardaanpak om dit probleem op te lossen het gebruiken van een sloophamer op het metabolisme van de bacterie. Onderzoekers verwijderden simpelweg de genen die verantwoordelijk waren voor concurrerende routes, waardoor de energieroutes effectief werden afgesneden om alle koolstof naar L-threonine te dwingen. Deze brute kracht werkte echter vaak averechts. Door deze concurrerende routes volledig te verwijderen, verloren de bacteriën hun vermogen om energie efficiënt te generen, wat leidde tot slechte groei en lage opbrengsten. Een nieuwe studie door onderzoekers van het Instituut voor Microbiologie in Guangdong, China, suggereert dat een subtielere, gecoördineerde aanpak veel beter werkt. In plaats van de concurrerende routes volledig te verwijderen, leerden zij ze te finetunen, waarbij ze de stroom van koolstof aanstuurden als een bekwame dirigent die een orkest beheert in plaats van instrumenten te verbijten.

De onderzoekers richtten zich op een specifiek knooppunt in de bacteriële cel dat bekend staat als de PEP-pyruvaat-oxaloacetaat-node. Stel je deze node voor als een druk kruispunt waar een stroom koolstofmoleculen moet kiezen tussen twee hoofdroutes: één leidt naar de tricarboxylzuurcyclus, een proces dat energie genereert voor de groei van de cel, en de andere leidt naar de productie van L-threonine. In een standaard bacteriële cel stroomt de meeste koolstof van nature naar de energieproductie, waardoor er zeer weinig overblijft voor de productie van het aminozuur. De twee belangrijkste enzymen die optreden als verkeersregelaars bij dit kruispunt zijn citraatsynthase en pyruvaatkinase. In eerdere pogingen probeerden wetenschappers deze enzymen volledig te verwijderen om de energieweg te blokkeren, maar dit zorgde ervoor dat de bacteriële cellen stopten met groeien en ook stopten met de productie van het aminozuur.

Het team realiseerde zich dat het probleem niet de aanwezigheid van deze routes was, maar de timing van hun activiteit. Ze hadden een manier nodig om de bacteriën eerst te laten groeien, gebruikmakend van de energiestromen, en vervolgens de stroom naar aminozuurproductie te schakelen zodra de populatie groot genoeg was. Om dit te bereiken, hebben ze de genen voor de verkeersregelaars niet verwijderd. In plaats daarvan hebben ze de genetische schakelaars die deze genen aan- en uitzetten, opnieuw bedraad. Ze gebruikten speciale promotors — genetische sequenties die fungsioneert als sensoren — om de groeifase van de bacteriën te detecteren. Tijdens de vroege, snelle groeifase hielden deze sensoren de energiestromen volledig open, waardoor de bacteriën een sterke populatie konden opbouwen. Zodra de bacteriën een tragere, stationaire fase bereikten waarin de groei van nature vertraagt, verminderden de sensoren automatisch de activiteit van de energiestromen. Deze subtiele verschuiving herleidde de overtollige koolstof die niet langer nodig was voor groei direct naar de L-threonine-productielijn.

Om dit systeem nog efficiënter te maken, combineerden de onderzoekers deze dynamische schakelaar met andere verbeteringen. Ze versterkten de specifieke stappen in de chemische keten die de grondstoffen omzetten in het uiteindelijke aminozuur en zorgden ervoor dat de bacteriën het product snel uit de cel kunnen exporteren. Ze pasten ook de aanvoer van een sleutelprecursor-molecuul aan om ervoor te zorgen dat de productielijn nooit droog kwam te staan. Cruciaal was dat ze al deze genetische veranderingen rechtstreeks in het hoofdchromosoom van de bacterie plaatsten, in plaats van ze op kleine, onstabiele ringen van DNA, genaamd plasmiden, te laten. Dit maakte de nieuwe stam stabiel en elimineerde de noodzaak voor antibiotica of chemische triggers om het systeem draaiende te houden, wat een aanzienlijk voordeel is voor industrieel gebruik.

De resultaten van deze gecoördineerde fijnafstemming waren opmerkelijk. In een eenvoudige laboratoriumkolf produceerden de gemanipuleerde bacteriën 28,3 gram L-threonine per liter vloeistof. Dit was een enorme verbetering ten opzien van de controlestam, die bijna niets produceerde. Wanneer de onderzoekers het proces naar een grotere bioreactor verplaatsten, om industriële omstandigheden te simuleren, produceerden de bacteriën 101,6 gram per liter. Het proces was zeer efficiënt en zette ongeveer 64 procent van de glucose-suiker die de bacteriën kregen, om in het aminozuur. Misschien wel het belangrijkste is dat de bacteriën tijdens de initiële fase net zo goed groeiden als normale cellen, wat bewees dat de strategie succesvol de behoeften van groei en productie in evenwicht hield zonder een van beide in gevaar te brengen.

Deze studie laat zien dat in metabole engineering precisie vaak wint van brute kracht. Door de natuurlijke ritmes van bacteriële groei te begrijpen en een systeem te ontwerpen dat die ritmes respecteert, waren de onderzoekers in staat om de cellen te verleiden tot uiterst efficiënte fabrieken. Ze toonden aan dat concurrerende routes niet vernietigd hoeven te worden om nuttig te zijn; ze moeten simpelweg worden beheerd. Deze aanpak van fijn afstemmen in plaats van verwijderen zou een blauwdruk kunnen vormen voor de productie van andere essentiële aminozuren en complexe chemicaliën, wat een duurzamere en effectievere manier biedt om de kracht van het microbiële leven te benutten.