Multiple Hypothesis Testing To Estimate The Number Of Communities in Stochastic Block Models

1. Il Problema

Il clustering dei dataset di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è fondamentale per comprendere l'eterogeneità cellulare e le funzioni biologiche. Tuttavia, l'implementazione di metodi di rilevamento delle comunità basati su reti per questi dati presenta sfide significative:

• Rumore elevato: I dati scRNA-seq sono intrinsecamente rumorosi a causa di cellule a bassa qualità, bassi conteggi di geni e contaminazione, il che oscura i segnali biologici.
• Dipendenza dal numero di comunità: La maggior parte dei metodi di rilevamento delle comunità (come gli algoritmi Louvain o Leiden) richiede a priori la conoscenza del numero reale di comunità (o blocchi) per stimare l'assegnazione dei membri.
• Sensibilità agli iperparametri: Le metodologie esistenti sono spesso sensibili alla scelta degli iperparametri e richiedono un fine-tuning manuale, rendendo i risultati instabili.
• Limitazioni dei metodi attuali: I metodi esistenti per stimare il numero di comunità (basati su verosimiglianza, validazione incrociata, programmazione semidefinita o metodi spettrali) spesso falliscono in reti sparse e rumorose, o sono computazionalmente costosi. In particolare, molti metodi soffrono quando il rapporto "out-in" (probabilità di connessione tra blocchi rispetto a quella intra-blocco) è alto, una condizione comune nei dati scRNA-seq.

2. Metodologia Proposta

Gli autori propongono una soluzione a due livelli per estrarre reti Stochastic Block Model (SBM) dai dati scRNA-seq e stimare il numero di comunità:

A. Estrazione della Rete SBM dai Dati scRNA-seq

Per trasformare i dati di espressione genica in una rete adatta all'analisi SBM, gli autori utilizzano un approccio basato sulla ricerca su griglia (grid-search) per selezionare automaticamente i migliori iperparametri, evitando il fine-tuning manuale:

1. Filtraggio e Normalizzazione: Rimozione di cellule e geni di bassa qualità, seguita da normalizzazione logaritmica.
2. Costruzione della Matrice di Adiacenza: Utilizzo della matrice di correlazione tra le cellule. La matrice di adiacenza viene costruita applicando una soglia basata sul $\kappa$-esimo quantile della distribuzione delle correlazioni.
3. Selezione Ottimale: Si valutano diverse combinazioni di iperparametri (filtri sui geni, soglia di correlazione, livello di significatività $\alpha$) selezionando quella che massimizza la verosimiglianza logaritmica sotto l'assunzione di un modello SBM.

B. Procedura di Test Multiplo Sequenziale (SMT)

Il cuore del contributo è il nuovo metodo SMT (Sequential Multiple Testing) per stimare il numero di comunità $K$.

• Idea Fondamentale: Un SBM con $K$ blocchi è equivalente a un insieme di $K$ blocchi distinti di grafi di Erdős-Rényi. Stimare $K$ equivale a stimare quanti blocchi di Erdős-Rényi distinti esistono nella rete.
• Test Statistico: Il metodo sfrutta la distribuzione asintotica del secondo autovalore della matrice di adiacenza scalata di un grafo di Erdős-Rényi, che segue una distribuzione di Tracy-Widom ($TW_1$).
  • Il primo autovalore rappresenta il segnale, mentre il secondo rappresenta il "rumore".
  • Se un blocco è effettivamente un grafo di Erdős-Rényi, il suo secondo autovalore (opportunamente centrato e scalato) dovrebbe seguire la distribuzione $TW_1$.
• Algoritmo:
  1. Si inizia con un'ipotesi di $K=1$ comunità.
  2. Si stima l'assegnazione delle comunità e si costruiscono le matrici di adiacenza per ogni blocco candidato.
  3. Si esegue un test di ipotesi sequenziale: $H_0$: tutti i $K$ blocchi selezionati sono grafi di Erdős-Rényi vs $H_1$: almeno uno non lo è.
  4. Per ottimizzare la potenza del test, si utilizza il complemento del grafo di Erdős-Rényi se la probabilità di connessione interna è $>0.5$, garantendo che la probabilità di connessione sia sempre $\le 0.5$.
  5. Si incrementa $K$ finché l'ipotesi nulla non viene accettata (il valore statistico del test è inferiore alla soglia critica $TW_1$).

3. Contributi Chiave

1. Nuovo Approccio SMT: Introduzione di una procedura di test multiplo sequenziale basata sulla distribuzione di Tracy-Widom del secondo autovalore, specificamente progettata per stimare $K$ in SBM.
2. Estrazione Robusta da scRNA-seq: Un framework automatizzato per convertire dati scRNA-seq rumorosi in reti SBM, selezionando dinamicamente gli iperparametri tramite massimizzazione della verosimiglianza.
3. Proprietà Teoriche: Dimostrazione della consistenza dell'estimatore $\hat{K}$ in condizioni di sparsità moderata. Il metodo garantisce che la probabilità di rifiutare modelli sottostimati (under-fitted) tenda a 1 (potenza asintotica unitaria).
4. Robustezza al Rapporto Out-In: A differenza di molti metodi spettrali o di verosimiglianza esistenti, SMT è meno sensibile all'aumento del rapporto tra probabilità di connessione inter-blocco e intra-blocco, rendendolo ideale per reti sparse e rumorose.

4. Risultati

• Simulazioni Numeriche:
  • Gli autori hanno confrontato SMT con metodi esistenti come LRBIC, StGoF, NCV, ECV, BHMC e EigCV.
  • I risultati mostrano che SMT mantiene alte prestazioni anche quando il rapporto out-in aumenta (fino a 0.6) e in scenari con molte comunità ($K=15, 20$) e reti grandi ($N=5000$).
  • Mentre altri metodi (specialmente NCV, ECV e StGoF) vedono un crollo dell'accuratezza all'aumentare del rumore o del rapporto out-in, SMT rimane stabile.
  • SMT è computazionalmente più efficiente rispetto ai metodi basati su verosimiglianza (che richiedono calcoli esponenziali) e alla validazione incrociata.
• Analisi su Dati Reali (Benchmark):
  • Applicazione su sei dataset di riferimento scRNA-seq (es. Biase, Yan, Deng).
  • Il metodo ha stimato il numero di comunità con un'accuratezza leggermente superiore o comparabile a SC3 (un metodo di riferimento), senza richiedere la sintonizzazione manuale degli iperparametri.
• Analisi su Dati Biologici (Retina Umana):
  • Applicazione su un dataset di cellule bipolari della retina umana. Il metodo ha identificato con successo sottogruppi cellulari coerenti con la biologia nota, dimostrando l'utilità pratica nell'analisi di dati reali complessi.

5. Significato e Impatto

Questo lavoro è significativo perché affronta direttamente la sfida del "rumore" e della "sparsità" nei dati biologici moderni (scRNA-seq).

• Riduzione della Dipendenza dall'Utente: Eliminando la necessità di un fine-tuning manuale degli iperparametri, il metodo rende l'analisi delle comunità più riproducibile e accessibile ai biologi.
• Validità Teorica in Regimi Realistici: Fornisce garanzie teoriche di consistenza in regimi di sparsità semi-densa, che sono più realistici per le reti biologiche rispetto ai regimi densi richiesti da molti metodi spettrali classici.
• Scalabilità: La natura computazionalmente efficiente di SMT lo rende adatto all'analisi di dataset di grandi dimensioni, che sono sempre più comuni nell'era della biologia single-cell.

In sintesi, gli autori offrono un approccio rigoroso e automatizzato che combina teoria delle reti probabilistiche e statistica asintotica per risolvere un problema pratico cruciale nella bioinformatica moderna: determinare quante tipologie cellulari distinte esistono in un campione rumoroso.