Identifying endogenous substrates of the 26S proteasome through site-specific photocrosslinking

Immaginate una città frenetica dove milioni di lavoratori stanno costantemente costruendo, riparando e demolendo strutture. In questa città, c'è un enorme impianto di riciclaggio ad alta sicurezza chiamato proteasoma. Il suo compito è prendere proteine vecchie, rotte o indesiderate (i lavoratori e i materiali della città) e sminuzzarle in parti grezze per essere riutilizzate. Questo è fondamentale perché se la città si intasasse di macchinari rotti, tutto si fermerebbe. Tuttavia, la città ha anche un altro metodo di riciclaggio chiamato lisosoma, che è più simile a una gigantesca compattatrice di rifiuti per rifiuti sfusi. La parte complicata per gli scienziati è distinguere tra gli oggetti specifici che vengono inviati al trituratore ad alta sicurezza del proteasoma rispetto alla compattatrice di massa. Di solito, possiamo solo vedere il mucchio di spazzatura dopo che è stata elaborata, rendendo difficile intercettare gli oggetti proprio mentre vengono inseriti nella macchina.

Per risolvere questo mistero, gli scienziati avevano bisogno di un modo per "scattare una foto" a una proteina nell'esatto momento in cui viene afferrata dal motore del proteasoma. Questo articolo introduce un trucco ingegnoso utilizzando un tipo speciale di "colla" che aderisce solo quando colpita da un colore di luce specifico. Usando questa colla attivata dalla luce, i ricercatori sono riusciti a congelare le proteine sul posto mentre venivano tirate all'interno del proteasoma, permettendoci di vedere esattamente cosa stava mangiando la macchina in quel momento. Questo è un grande passo avanti perché ci aiuta a capire come le cellule decidano cosa distruggere, il che è vitale per comprendere le malattie in cui questo sistema di riciclaggio va storto, come il cancro o la neurodegenerazione.

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Catturare i raccoglitori di rifiuti della cellula sul colto

Nel mondo microscopico di una cellula di lievito, il proteasoma 26S è l'ultimo raccoglitore di rifiuti. È una macchina gigante e complessa che dà la caccia a proteine specifiche contrassegnate per la distruzione, le smonta e ricicla i pezzi. Ma catturare queste proteine nell'atto di essere mangiate è stato incredibilmente difficile. È come cercare di scattare una foto a una specifica formica che viene trasportata in un formicaio quando milioni di formiche si affollano intorno, e la formica scompare nel tunnel buio prima che tu possa scattare l'otturatore.

I ricercatori di questo studio hanno ideato una strategia brillante per risolvere questo "problema dello scatto". Hanno deciso di installare una piccola trappola sensibile alla luce all'interno del motore stesso del proteasoma.

La trappola attivata dalla luce
Il team ha utilizzato una tecnica chiamata "espansione del codice genetico" per inserire un amminoacido speciale, non naturale, chiamato Bpa (p-benzoil-L-fenilalanina), nel cuore del motore del proteasoma. Pensate al Bia come a una piccola pistola per colla dormiente nascosta tra gli ingranaggi della macchina. In condizioni normali, sta ferma in silenzio. Ma quando si illumina con una specifica luce ultravioletta (365 nm), il Bpa si sveglia e spara istantaneamente un raggio appiccicoso in tutte le direzioni, legandosi a tutto ciò che tocca.

Gli scienziati hanno posizionato questa "pistola per colla" nel loop pore-1 di una subunità motrice chiamata Rpt1. Questo è un punto specifico all'interno del canale centrale attraverso il quale la proteina che viene distrutta viene tirata. È come posizionare la pistola per colla proprio nel corridoio dove la spazzatura viene trascinata dentro. Se una proteina si trova solo nei paraggi all'esterno della macchina, la colla non la toccherà. Ma se una proteina è destinata alla distruzione e viene attivamente tirata attraverso il motore, la colla si aggancerà a lei nel momento in cui la luce la colpisce.

Testare la trappola in laboratorio
Prima di provare questo nelle cellule viventi, il team ha costruito un modello di proteasoma in una provetta per assicurarsi che la loro trappola funzionasse. Hanno creato una versione della macchina con la pistola per colla Bpa e hanno alimentato la macchina con una proteina modello. Quando hanno fatto risplendere la luce UV, la colla ha incollato con successo la proteina modello al motore. Fondamentalmente, hanno scoperto che la macchina funzionava ancora perfettamente; poteva ancora tirare dentro le proteine e tritarle. Ciò ha dimostrato che l'aggiunta della trappola non aveva rotto la macchina.

Hanno anche testato se la trappola fosse abbastanza selettiva. Hanno provato a dare alla macchina una proteina troppo corta per essere tirata dentro (come un pezzo di corda troppo corto per essere afferrato). La colla non si è attaccata. Ciò ha confermato che la trappa cattura solo le proteine che vengono effettivamente trascinate attraverso il motore, non semplici proteine che per caso urtano la macchina.

L'esperimento nelle cellule viventi
Successivamente, hanno spostato l'esperimento in cellule di lievito viventi. Questo è stato complicato perché il proteasoma è essenziale per la vita; se lo avessero rotto o rallentato troppo, le cellule sarebbero morte. Per evitare questo, non hanno sostituito tutti i proteasomi. Invece, hanno aggiunto una seconda copia extra della subunità del motore Rpt1 contenente la trappola Bpa. Ciò significava che solo una piccola percentuale dei proteasomi nella cellula aveva la trappola, mentre il resto manteneva la cellula in funzione normalmente.

Hanno fatto crescere il lievito in una dieta speciale contenente il mattone fondamentale Bpa e un ormone (progesterone) per attivare la trappola. Una volta che le cellule erano pronte, le hanno divise in due gruppi: un gruppo è rimasto al buio, e l'altro è stato esposto alla luce UV a 365 nm per 15 minuti.

I risultati: Uno scatto della dieta
Quando hanno analizzato le proteine catturate dalla trappola, hanno trovato un tesoro di dati.

• Nelle cellule in crescita normale: La trappola ha catturato un mix diversificato di 343 diverse proteine. Molte di queste erano legate alla creazione di nuove proteine (traduzione), alla copia del DNA e alla gestione dell'energia. Questo ha senso perché le cellule che crescono velocemente devono costantemente regolare il proprio macchinario.
• Sotto stress: Il team ha poi messo sotto stress le cellule aggiungendo un farmaco chiamato tunicamicina, che altera la capacità della cellula di ripiegare correttamente le proteine, causando un accumulo nel "reticolo endoplasmatico" (un pavimento di fabbrica all'interno della cellula). Quando hanno ripetuto l'esperimento, la lista delle proteine intrappolate è cambiata drasticamente. Improvvisamente, la trappola stava catturando un numero enorme di proteine che avrebbero dovuto essere inviate alla superficie cellulare o al mondo esterno (proteine secretorie), molte delle quali non si erano ripiegate correttamente.

Questo cambiamento ha dimostrato che il metodo funziona. Il proteasoma non stava solo mangiando spazzatura casuale; stava prendendo di mira specificamente le proteine che stavano causando problemi a causa dello stress. I ricercatori hanno anche confermato che queste proteine intrappolate stavano effettivamente venendo degradate dal proteasoma usando un farmaco che blocca il proteasoma; quando la macchina veniva fermata, le proteine "intrappolate" si accumulavano, provando che erano in viaggio verso la distruzione.

Perché questo è importante
Questo articolo non ci fornisce solo un elenco di proteine; ci fornisce un nuovo modo per osservare il proteasoma in azione. Usando questa colla attivata dalla luce, gli scienziati possono ora vedere esattamente cosa la cellula decide di distruggere in diverse condizioni — che stia crescendo normalmente, sotto stress o forse in uno stato patologico. È come avere finalmente una telecamera di sicurezza all'interno dell'impianto di riciclaggio, che ci mostra esattamente quali articoli vengono segnalati per la distruzione e perché. Questo potrebbe aiutarci a capire come le cellule gestiscono lo stress e come le cose vanno male nelle malattie in cui il sistema di raccolta dei rifiuti fallisce.