Transfected plasmids have reduced expression in cells deficient in SEPTIN 9 or ESCRT proteins
Questo studio dimostra che l'espressione dei plasmidi trasfettati è significativamente ridotta nelle cellule prive di SEPTIN 9 o di proteine ESCRT a causa dell'alterazione dell'acidificazione endosomiale e della fuga endosomiale, rispettivamente, rivelando che il destino predefinito del DNA trasfettato è l'autofagia piuttosto che un efficace rilascio citoplasmatico.
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Per fornire una nuova istruzione a una cellula, gli scienziati utilizzano spesso un metodo chiamato trasfezione, in cui introducono un piccolo pezzo di DNA circolare noto come plasmide. L'obiettivo è che questo materiale genetico entri nella cellula e inizi a lavorare, ad esempio per produrre una proteina o per agere come strumento di ricerca. Tuttavia, il viaggio è pieno di ostacoli. Quando questi plasmidi vengono introdotti, sono solitamente confezionati all'interno di minuscoli vettori simili a bolle fatti di grassi e proteine. La cellula scambia questi vettori per cibo o carico utile e li inghiotte interamente attraverso un processo chiamato endocitosi. Una volta all'interno, i plasmidi rimangono intrappolati in un compartimento delimitato da una membrana chiamato endosoma. Affinché l'istruzione genetica funzioni, il plasmide deve sfuggire a questa trappola e raggiungere il principale spazio di lavoro della cellula, il citoplasma. Questa fuga è notoriamente difficile e inefficiente, e la maggior parte delle volte il plasmide rimane bloccato all'interno dell'endosoma, dove viene infine degradato senza mai svolgere il proprio compito. Comprendere esattamente come queste particelle rimangano intrappolate e cosa aiuti loro a liberarsi è essenziale per migliorare il modo in cui gli scienziati consegnano il materiale genetico alle cellule.
I ricercatori hanno recentemente investigato la specifica macchina cellulare che influenza questa fuga, concentrandosi su due gruppi distinti di proteine: SEPTIN 9 e una famiglia di proteine note come complesso ESCRT. Il team ha iniziato rimuovendo, o depletando, la proteina SEPTIN 9 dalle cellule e osservando cosa accadeva ai plasmidi trasfettati. Hanno scoperto che, in assenza di questa proteina, l'espressione del plasmide diminuiva significativamente. Questo risultato non era dovuto semplicemente al fatto che le cellule avessero smesso di ingerire i vettori plasmidici; l'assorbimento rimaneva normale. Inveve, l'assenza di SEPTIN 9 sembrava impedire agli endosomi contenenti i plasmidi di diventare acidi. Poiché la fuga di queste particelle spesso si basa su un cambiamento di acidità per innescare un rilascio, la mancanza di acidificazione significava che i plasmidi rimanevano bloccati. I ricercatori hanno concluso che SEPTIN 9 svolge un ruolo primario nel facilitare la fuga dei plasmidi dagli endosomi, la quale è sensibile al pH.
L'indagine ha preso una piega più drammatica quando il team ha esaminato le proteine ESCRT, nello specifico VPS36 e ALIX. Quando queste proteine venivano rimosse, l'espressione dei plasmidi trasfettati diminuiva ancora più drasticamente rispetto alla perdita di SEPTIN 9. In queste cellule, il DNA trasfettato non riusciva a colocalizzare, ovvero a condividere lo spazio, con CHMP4, una specifica proteina ESCRT che aiuta a rimodellare le membrane degli endosomi per formare vescicole interne. Questa mancanza di interazione suggeriva che il macchinario ESCRT sia critico per la consegna di successo del materiale genetico, probabilmente gestendo i cambiamenti strutturali nell'endosoma che permettono al plasmide di uscire.
Forse la scoperta più rivelatrice riguardava il destino finale dei plasmidi che non riuscivano a sfuggire. I ricercatori hanno osservato che il DNA trasfettato colocalizzava fortemente con LC3B, una proteina marker associata all'autofagia. L'autofagia è il sistema di riciclo naturale della cellula, un processo in cui la cellula inglofa i propri componenti o invasori esterni per decomporli. La forte presenza dei plasmidi insieme a questo marker suggerisce che, quando i meccanismi di fuga falliscono, il percorso predefinito per il materiale trasfettato è quello di essere raccolto dal sistema di riciclo della cellula e distrutto. Questa scoperta dipinge un quadro chiaro del paesaggio cellulare: i plasmidi vengono inghiottiti, lottano per sfuggire alle trappole acide dell'endosoma e, se non riescono a liberarsi con l'aiuto di SEPTIN 9 o del macchinario ESCRT, vengono inevitabilmente indirizzati verso il sistema di smaltimento dei rifiuti della cellula.
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