Transfected plasmids have reduced expression in cells deficient in SEPTIN 9 or ESCRT proteins
Deze studie toont aan dat de expressie van getransfecteerde plasmiden significant verminderd is in cellen die SEPTINE 9 of ESCRT-eiwitten missen vanwege een verstoorde endosomale verzuring en ontsnapping respectievelijk, wat onthult dat het standaard lot van getransfecteerd DNA autofagie is in plaats van succesvolle cytoplasmatische levering.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om een nieuwe instructie aan een cel te leveren, gebruiken wetenschappers vaak een methode genaamd transfectie, waarbij ze een klein, cirkelvormig stuk DNA dat een plasmide wordt genoemd, introduceren. Het doel is dat dit genetische materiaal de cel binnendringt en begint te werken, bijvoorbeeld om een eiwit te produceren of om als instrument voor onderzoek te dienen. De reis is echter vol obstakels. Wanneer deze plasmiden worden geïntroduceerd, worden ze meestal verpakt in piepkleine, belvormige dragers gemaakt van vet en eiwit. De cel verwart deze dragers met voedsel of nuttige lading en slikt ze in zijn geheel in via een proces dat endocytose wordt genoemd. Eenmaal binnen zitten de plasmiden gevangen in een membraangebonden compartiment dat een endosoom wordt genoemd. Voor het werk van de genetische instructie moet het plasmide uit deze val ontsnappen en de hoofdwerkplaats van de cel, het cytoplasma, bereiken. Deze ontsnapping is berucht moeilijk en inefficiënt, en meestal blijft het plasmide vastzitten in het endosoom, waar het uiteindelijk wordt afgebroken zonder ooit zijn werk te doen. Begrijpen hoe deze deeltjes precies gevangen raken en wat hen helpt om vrij te breken, is essentieel voor het verbeteren van de manier waarop wetenschappers genetisch materiaal in cellen leveren.
Onderzoekers onderzochten onlangs de specifieke cellulaire machinerie die deze ontsnapping beïnvloedt, waarbij ze zich concentreerden op twee verschillende groepen eiwitten: SEPTINE 9 en een familie eiwitten die bekend staat als het ESCRT-complex. Het team begon door SEPTINE 9 uit cellen te verwijderen, of te depletteren, en te observeren wat er gebeurde met de getransfecteerde plasmiden. Ze ontdekten dat zonder dit eiwit de expressie van het plasmide aanzienlijk daalde. Dit resultaat kwam niet simpelweg doordat de cellen stopten met het opnemen van de plasmidadragers; de opname bleef normaal. In plaats daarvan leek de afwezigheid van SEPTINE 9 te voorkomen dat de endosomen die de plasmiden bevatten, zuur werden. Aangezien het ontsnappen van deze deeltjes vaak steunt op een verandering in zuurgraad om een vrijgave te triggeren, betekende het gebrek aan verzuring dat de plasmiden vast bleven zitten. De onderzoekers concludeerden dat SEPTINE 9 een primaire rol speelt bij het faciliteren van de pH-gevoelige ontsnapping van plasmiden uit hun endosomale kooien.
De onderzoeken namen een dramatischer wending toen het team naar de ESCRT-eiwitten keek, specifiek VPS36 en ALIX. Wanneer deze eiwitten werden verwijderd, daalde de expressie van de getransfecteerde plasmiden zelfs nog scherper dan bij het verlies van SEPTINE 9. In deze cellen slaagde het getransfecteerde DNA er niet in om te colocaliseren, of dezelfde ruimte te delen, met CHMP4, een specifiek ESCT-eiwit dat helpt bij het hervormen van de membranen van endosomen om interne blaasjes te vormen. Dit gebrek aan interactie suggereerde dat de ESCRT-machinerie cruciaal is voor de succesvolle levering van het genetische materiaal, waarschijnlijk door het beheren van de structurele veranderingen in het endosoom die het plasmide de mogelijkheid geven om te ontsnappen.
Misschien wel de meest onthullende ontdekking betrof het uiteindelijke lot van de plasmiden die er niet in slaagden te ontsnappen. De onderzoekers observeerden dat het getransfecteerde DNA sterk colocaliseerde met LC3B, een marker-eiwit geassocieerd met autofagie. Autofagie is het natuurlijke recyclingsysteem van de cel, een proces waarbij de cel zijn eigen componenten of vreemde indringers opslokt om ze af te breken. De sterke aanwezigheid van de plasmiden naast deze marker suggereert dat wanneer de ontsnappingsmechanismen falen, de standaardroute voor het getransfecteerde materiaal is om te worden meegesleept door het recyclingsysteem van de cel en te worden vernietigd. Deze bevinding schetst een duidelijk beeld van het cellulaire landschap: de plasmiden worden ingeslikt, ze worstelen om te ontsnappen aan de zure vallen van het endosoom, en als ze niet met de hulp van SEPTINE 9 of de ESCRT-machinerie kunnen ontsnappen, worden ze onvermijdelijk naar het afvalsysteem van de cel geleid.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.