Megascale recombination generates millions of catalytically competent PETases
Questo studio dimostra che la ricombinazione su scala megasize di dieci sequenze di PETasi batteriche può generare milioni di enzimi chimerici diversi e cataliticamente competenti, provando che la ricombinazione di sequenze su larga scala è una strategia scalabile ed efficace per l'ingegneria proteica compatibile con lo screening moderno ad alto rendimento.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Le proteine sono le macchine microscopiche che alimentano la vita, ripiegandosi in forme intricate per svolgere compiti specifici come scomporre il cibo o costruire le cellule. Per decenni, gli scienziati che hanno cercato di migliorare queste macchine si sono affidati a un metodo di tentativi ed errori che consiste nel apportare piccole modifiche casuali al codice di una proteina, sperando di trovarne una versione migliore. Questo approccio funziona bene per piccoli aggiustamenti, ma fatica quando l'obiettivo è creare qualcosa di completamente nuovo o esplorare il vasto panorama di tutte le possibili forme proteiche. Una strategia più potente prevede la ricombinazione, un processo in cui gli scienziati tagliano e incollano grandi frammenti di DNA da diverse proteine naturalmente esistenti per creare versioni ibride. Sebbene questo metodo possa generare una diversità enorme, una domanda persistente è stata se questi ibridi simili a Frankenstein potessero ancora funzionare. Se si mescolano troppi pezzi provenienti da fonti diverse, la macchina si rompe o riesce comunque a funzionare?
Un team di ricercatori della Duke University e della University of California, Berkeley, si è posto l'obiettivo di rispondere a questo quesito costruendo una libreria di enzimi ibridi su una scala mai tentata prima d'ora. Si sono concentrati su un tipo specifico di proteina chiamata PETasi, che naturalmente mangia la plastica, e hanno combinato frammenti genetici di dieci diverse versioni batteriche di questo enzima. Cucendo insieme dieci blocchi distinti di DNA da questi dieci genitori, hanno creato una libreria teorica contenente dieci miliardi di combinazioni uniche. La sfida centrale non era solo creare questi miliardi di varianti, ma trovare le poche che funzionassero ancora. Per farlo, gli scienziati hanno utilizzato cellule di lievito come minuscole fabbriche per esporre le proteine sulle loro superfici. Hanno poi introdotto una sonda chimica speciale che si attacca solo al centro attivo di un enzima funzionante. Se la sonda si attaccava, significava che la proteina ibrida si era ripiegata con successo in una forma dotata di una parte funzionale operativa, nonostante fosse composta da pezzi provenienti da dieci diversi antenati.
I risultati sono stati sorprendenti. Nonostante il fatto che ogni enzima ibrido contenesse decine di cambiamenti rispetto al suo parente naturale più stretto, circa il due percento delle miliardi di varianti nella libreria mostrava ancora segni di funzionalità. Questa piccola percentuale si traduce in un numero stimato di cento milioni di enzimi funzionanti nascosti all'interno della massiccia libreria. I ricercatori hanno poi utilizzato una macchina di smistamento per separare il lievito funzionante da quello non funzionante, arricchendo la popolazione di enzimi attivi dal due percento a oltre il sessanta percento in un unico passaggio. Ciò ha dimostrato che gli enzimi non avevano bisogno di essere quasi identici ai loro genitori per funzionare; potevano essere radicalmente diversi e mantenere comunque la loro capacità di operare.
Per confermare che queste scoperte non fossero un artefatto del sistema di esposizione del lievito, il team ha preso gli ibridi più promettenti e li ha prodotti in batteri, un tipo di cellula diverso, per vedere se potessero essere purificati e testati in un ambiente di laboratorio standard. Hanno esaminato cinquanta dei migliori candidati utilizzando un test liquido che misura quanto bene l'enzima scompone una sostanza simile alla plastica. Diversi degli enzimi ibridi hanno performato quanto, o anche meglio, dell'enzima naturale originale. I ricercatori hanno poi purificato i tre migliori esecutori per misurare con precisione la loro attività. Questi enzimi purificati, che sono mosaici di dieci diversi genitori, hanno mantenuto la loro capacità di scomporre efficacemente il substrato. Lo studio ha dimostrato che gli enzimi funzionanti non erano tutti cloni di un singolo design perfetto; al contrario, rappresentavano una vasta gamma di diverse combinazioni genetiche, suggerendo che la natura ha molti modi diversi per risolvere lo stesso problema.
Questo lavoro dimostra che gli scienziati possono ora generare e analizzare librerie di proteine che siano abbastanza grandi da corrispondere alle capacità della moderna tecnologia di screening ad alto rendimento. Dimostrando che la massiccia ricombinazione non distrugge la funzione, lo studio apre la porta all'esplorazione di vasti territori dello spazio proteico che erano precedentemente troppo rischiosi da investigare. Suggerisce che il percorso per scoprire nuovi enzimi o migliorare quelli esistenti non richiede di partire da zero o di apportare piccoli cambiamenti incrementali. Invece, è possibile mescolare e abbinare grandi pezzi di codice genetico da fonti diverse e trovare ancora soluzioni funzionanti. Questo approccio fornisce un modo scalabile per generare le enormi quantità di dati necessarie per addestrare modelli informatici, portando potenzialmente alla scoperta di enzimi in grado di affrontare difficili sfide ambientali o di eseguire nuove reazioni chimiche che la natura non ha ancora inventato.
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