Megascale recombination generates millions of catalytically competent PETases
Diese Studie zeigt, dass die Rekombination im Megamaßstab von zehn bakteriellen PETase-Sequenzen Millionen von diversen, katalytisch kompetenten chimären Enzymen erzeugen kann, was beweist, dass groß angelegte Sequenzrekombination eine skalierbare und effektive Strategie für das Proteinengineering ist, die mit modernem Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Proteine sind die mikroskopischen Maschinen, die das Leben antreiben, indem sie sich in komplizierte Formen falten, um spezifische Aufgaben zu erfüllen, wie etwa die Verdauung von Nahrung oder den Aufbau von Zellen. Jahrzehntelang verließen sich Wissenschaftler, die versuchen, diese Maschinen zu verbessern, auf eine Methode des Ausprobierens und Irrens, bei der winzige, zufällige Änderungen am Code eines Proteins vorgenommen werden, in der Hoffnung, eine bessere Version zu finden. Dieser Ansatz funktioniert gut für kleine Anpassungen, stößt aber an seine Grenzen, wenn das Ziel darin besteht, etwas völlig Neues zu erschaffen oder die riesige Landschaft aller möglichen Proteinformen zu erkunden. Eine leistungsfähigere Strategie beinhaltet die Rekombination, einen Prozess, bei dem Wissenschaftler große DNA-Stücke von verschiedenen, natürlich vorkommenden Proteinen ausschneiden und zusammenfügen, um Hybridversionen zu erstellen. Während diese Methode eine massive Diversität erzeugen kann, blieb die unbeantwortete Frage, ob diese Frankenstein-ähnlichen Hybride noch funktionsfähig sein könnten. Wenn man zu viele Teile aus verschiedenen Quellen mischt, bricht die Maschine dann zusammen oder kann sie dennoch weiterlaufen?
Ein Team von Forschern der Duke University und der University of California, Berkeley, setzte sich zum Ziel, dies zu beantworten, indem sie eine Bibliothek von Enzym-Hybriden in einem bisher nie dagewesenen Ausmaß aufbaute. Sie konzentrierten sich auf eine spezifische Art von Protein namens PETase, die natürlicherweise Kunststoff frisst, und kombinierten genetische Fragmente von zehn verschiedenen bakteriellen Versionen dieses Enzyms. Durch das Zusammennähen von zehn unterschiedlichen DNA-Blöcken aus diesen zehn Eltern erstellten sie eine theoretische Bibliothek, die zehn Milliarden einzigartige Kombinationen enthielt. Die zentrale Herausforderung bestand nicht nur darin, diese Milliarden von Varianten herzustellen, sondern diejenigen wenigen zu finden, die noch funktionierten. Um dies zu erreichen, nutzten die Wissenschaftler Hefezellen als winzige Fabriken, um die Proteine auf ihrer Oberfläche darzustellen. Anschließend führten sie eine spezielle chemische Sonde ein, die nur an das aktive Zentrum eines funktionierenden Enzyms bindet. Wenn sich die Sonde anhaftete, bedeutete dies, dass das Hybridprotein erfolgreich in eine Form gefaltet war, die einen funktionierenden, arbeitenden Teil besaß, obwohl es aus Teilen von zehn verschiedenen Vorfahren zusammengesetzt war.
Die Ergebnisse waren beeindruckend. Trotz der Tatsache, dass jedes Hybridenzym Dutzende von Veränderungen im Vergleich zu seinem nächsten natürlichen Verwandten aufwies, zeigten etwa zwei Prozent der Milliarden Varianten in der Bibliothek immer noch Anzeichen dafür, funktionsfähig zu sein. Diese kleine Prozentzahl entspricht einer geschätzten Anzahl von einhundert Millionen funktionierenden Enzymen, die in der massiven Bibliothek verborgen sind. Die Forscher nutzten dann eine Sortiermaschine, um die funktionierenden Hefezellen von den nicht funktionierenden zu trennen, wodurch sie die Population der aktiven Enzyme in einer einzigen Runde von zwei Prozent auf über sechzig Prozent anreicherten. Dies bewies, dass die Enzyme nicht nahezu identisch mit ihren Eltern sein mussten, um zu funktionieren; sie konnten radikal anders sein und dennoch ihre Fähigkeit behalten, zu arbeiten.
Um zu bestätigen, dass diese Ergebnisse kein Artefakt des Hefedisplay-Systems waren, produzierten die Wissenschaftler die vielversprechendsten Hybride in Bakterien – einer anderen Art von Zelle –, um zu sehen, ob sie in einem Standardlaborumfeld gereinigt und getestet werden konnten. Sie untersuchten fünfzig der besten Kandidaten mit einem Flüssigkeitstest, der misst, wie gut das Enzym eine kunststoffähnliche Substanz abbaut. Einige der Hybridenzyme schnitten so gut ab wie oder sogar besser als das ursprüngliche natürliche Enzym. Die Forscher reinigten drei der besten Performer, um deren Aktivität präzise zu messen. Diese gereinigten Enzyme, die Mosaike aus zehn verschiedenen Eltern waren, behielten ihre Fähigkeit bei, das Substrat effektiv abzubauen. Die Studie zeigte, dass die funktionierenden Enzyme nicht alle Klone eines einzigen perfekten Designs waren; stattdessen repräsentierten sie eine breite Vielfalt an unterschiedlichen genetischen Kombinationen, was darauf hindeutet, dass die Natur viele verschiedene Wege hat, dasselbe Problem zu lösen.
Diese Arbeit zeigt, dass Wissenschaftler nun in der Lage sind, Proteinbibliotheken zu generieren und zu screenen, die groß genug sind, um den Kapazitäten moderner Hochdurchsatz-Screening-Technologien zu entsprechen. Indem sie zeigten, dass massive Rekombination die Funktion nicht zerstört, öffnet die Studie die Tür zur Erforschung riesiger Regionen des Proteinraums, die zuvor als zu riskant galten. Es legt nahe, dass der Weg zur Entdeckung neuer Enzyme oder zur Verbesserung bestehender nicht erfordert, bei Null anzufangen oder winzige, schrittweise Änderungen vorzunehmen. Stattdessen ist es möglich, große Teile des genetischen Codes aus diversen Quellen zu mischen und zu kombinieren und dennoch funktionierende Lösungen zu finden. Dieser Ansatz bietet einen skalierbaren Weg, um die massiven Mengen an Daten zu generieren, die benötigt werden, um Computermodelle zu trainieren, was potenziell zur Entdeckung von Enzymen führen kann, die schwierige Umweltprobleme bewältigen oder neue chemische Reaktionen durchführen können, die die Natur selbst noch nicht erfunden hat.
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