Small-Molecule Inhibitors Allosterically Control Bruton's Tyrosine Kinase Assembly on the Membrane

All'interno del corpo umano, una complessa rete di segnali chimici mantiene le cellule in comunicazione, permettendo loro di crescere e rispondere all'ambiente circostante. Quando questi segnali si guastano, possono causare malattie come il cancro. Uno dei messaggeri chiave in questo sistema è una proteina chiamata tirosina chinasi di Brut, o Btk. Pensate alla Btk come a un interruttore che aiuta le cellule immunitarie a decidere quando combattere un'infezione. In certi tipi di cancro del sangue, questo interruttore rimane bloccato sulla posizione "on", facendo sì che le cellule si moltiplichino in modo incontrollato. Per anni, i medici hanno trattato questi tumori con farmaci progettati per bloccare il meccanismo principale dell'interruttore, spegnendo efficacementamente la proteina. Tuttavia, gli scienziati hanno scoperto recentemente un problema: anche quando il meccanismo principale viene bloccato, la proteina può talvolta continuare a inviare segnali, portando alla resistenza ai farmaci. Questo accade perché la Btk non agisce solo come un interruttore, ma anche come uno scaffold, ovvero una piattaforma strutturale che riunisce altre proteine sulla superficie della membrana cellulare per organizzare complessi eventi di segnalazione.

Un team di ricercatori della Colorado State University e della Iowa State University ha ora scoperto uno strato nascosto di controllo su come la Btk si organizza. Hanno scoperto che i farmaci utilizzati per trattare questi tumori fanno molto di più che fermare l'attività enzimatica della proteina; essi cambiano anche il modo in cui la proteina si dispone sulla superficie cellulare. Osservando le singole proteine muoversi e raggrupparsi su una membrana cellulare modello, gli scienziati hanno scoperto che diversi farmaci fanno comportare alla B in modi completamente differenti. Alcuni farmaci incoraggiano le proteine a raggrupparsi in grandi gruppi organizzati, mentre altri le lasciano sparse e disperse. Questa scoperta suggerisce che la scelta del farmaco è importante non solo per quanto bene interrompa il compito principale della proteina, ma anche per come rimodelli la sua struttura fisica e la sua capacità di agire come scaffold per il resto del macchinario cellulare.

Per vedere questi processi invisibili in azione, i ricercatori hanno creato una versione semplificata di una membrana cellulare in una capsula di Petri. Hanno utilizzato uno strato sottile di lipidi, le molecole grasse che compongono le pareti cellulari, e hanno aggiunto un tipo specifico di molecola di segnalazione che attira naturalmente la Btk. Successivamente, hanno introdotto la proteina Btk, che era stata marcata con un segnale fluorescente affinché potessero osservarla sotto un microscopio speciale. Quando hanno aggiunto la proteina insieme all'ATP, la principale fonte di energia della cellula, hanno osservato le proteine Btk radunarsi sulla membrana. Con il passare del tempo, queste proteine non sono rimaste semplicemente lì; hanno iniziato a formare grandi cluster visibili, o assemblaggi, che si estendevano sulla superficie. Questo raggruppamento è un passaggio cruciale nel normale funzionamento della Btk, che le permette di interagire con altre proteine e trasmettere segnali.

Il team ha poi testato se la capacità della proteina di formare questi cluster dipendesse dalla sua principale attività enzimatica. Hanno scoperto che la proteina poteva ancora assemblarsi in grandi gruppi anche quando veniva impedita chimicamente di svolgere il suo lavoro enzimatico. Ciò ha dimostrato che l'atto fisico del raggruppamento è separato dalla reazione chimica che la proteina normalmente catalizza. Per capire cosa guidasse questo raggruppamento, hanno esaminato le parti specifiche della proteina che le permettono di attaccarsi tra loro. Hanno scoperto che due regioni specifiche della proteina devono interagire affinché si formino i cluster. Se hanno interrotto queste connessioni utilizzando mutazioni genetiche, le proteine sono rimaste sparse, indipendentemente dalla quantità di energia presente. Ciò ha confermato che la proteina si affida a specifiche interfacce strutturali per costruire i suoi assemblaggi.

La scoperta più sorprendente è avvenuta quando i ricercatori hanno testato vari farmaci progettati per inibire la Btk. Hanno confrontato diversi medicinali ampiamente utilizzati, inclusi gli inibitori covalenti che si legano saldamente e permanentemente, e gli inibitori non covalenti che si legano più debolmente. Si aspettavano che tutti questi farmaci avrebbero semplicemente interrotto il funzionamento della proteina. Invece, hanno osservato una divergenza nel comportamento. Farmaci come ibrutinib, acalabrutinib e dasatinib hanno fatto sì che le proteine Btk formassero grandi cluster densi sulla membrana, in modo molto simile a quanto accadeva con l'ATP. Al contrario, farmaci come fenebrutinib e pirtobrutinib hanno lasciato le proteine sparse e disperse, nonostante anche questi farmaci bloccassero con successo l'attività enzimatica della proteina. Ciò significava che i farmaci non stavano solo spegnendo la proteina, ma stavano attivamente plasmando il modo in cui la proteina si organizza sulla superficie cellulare.

Per capire perché diversi farmaci producessero risultati così differenti, i ricercatori hanno esaminato la forma e la flessibilità della proteina. Hanno utilizzato una tecnica che misura come la proteina "respira" e si muove a livello molecolare. Hanno scoperto che i farmaci che promuovevano il raggruppamento rendevano alcune parti della proteina più flessibili e aperte, in particolare nelle regioni che fungono da siti di aggancio per altre proteine. Viceversa, i farmaci che mantenevano le proteine sparse rendevano queste stesse regioni più rigide e chiuse. Ciò suggerisce che i farmaci agiscano come regolatori allosterici, ovvero si legano a una parte della proteina e causano un cambiamento di forma che si propaga attraverso le parti distanti della molecola. Quando la proteina si trova in uno stato flessibile e aperto, può facilmente afferrare altre proteine e formare i grandi assemblaggi osservati sulla membrana. Quando è bloccata in uno stato rigido, non può formare queste connessioni.

I ricercatori hanno ulteriormente confermato questo punto testando se altre proteine potessero attaccarsi ai cluster di Btk. Hanno introdotto una proteina ausiliaria chiamata Grb2, che normalmente si lega a una regione specifica della Btk per aiutare la trasmissione dei segnali. Hanno scoperto che Grb2 si attaccava facilmente ai cluster di Btk formati in presenza di ATP o dei farmaci che promuovono il raggruppamento. Tuttavia, Grb2 non riusciva ad attaccarsi alle proteine Btk disperse presenti in presenza dei farmaci che non promuovono il raggruppamento. Ciò ha fornito una prova diretta che i farmaci che impediscono il raggruppamento impediscono anche alla proteina di agire come scaffold. In altre parole, questi farmaci non si limitano a spegnere il motore; smantellano il telaio che sostiene il macchinario di segnalazione.

Questo lavoro rivela un nuovo modo di intendere il funzionamento degli inibitori delle chinasi. Per molto tempo, l'attenzione si è concentrata interamente sulla capacità di un farmaco di bloccare il sito attivo di una proteina. Questo studio dimostra che l'effetto del farmaco sulla forma complessiva della proteina e sulla sua capacità di organizzarsi sulla membrana è altrettanto importante. Diversi farmaci che colpiscono lo stesso punto possono produrre stati fisici distinti della proteina, portando a esiti biologici differenti. Questa distinzione potrebbe spiegare perché alcuni pazienti sviluppino resistenza a certi trattamenti mentre altri no. Se un farmaco lascia la proteina in uno stato in cui può ancora assemblarsi e reclutare altri partner di segnalazione, le cellule cancerose potrebbero trovare un modo per aggirare il blocco e continuare a crescere. I risultati suggeriscono che la prossima generazione di terapie oncologiche potrebbe dover considerare non solo l'inibizione chimica di una proteina, ma anche come quel farmaco influenzi l'organizzazione fisica della proteina e il suo ruolo di scaffold nella cellula.