Small-Molecule Inhibitors Allosterically Control Bruton's Tyrosine Kinase Assembly on the Membrane

Binnen het menselijk lichaam houdt een complex netwerk van chemische signalen de cellen in staat om met elkaar te communiceren, te groeien en te reageren op hun omgeving. Wanneer deze signalen fout gaan, kan dit leiden tot ziekten zoals kanker. Een van de belangrijkste boodschappers in dit systeem is een eiwit genaamd Bruton's tyrosinekinase, of Btk. Denk aan Btk als een schakelaar die immuuncellen helpt beslissen wanneer ze een infectie moeten bestrijden. Bij bepaalde typen bloedkanker blijft deze schakelaar in de "aan"-positie hangen, waardoor cellen ongecontroleerd gaan vermenigvuldigen. Jarenlang hebben artsen deze kankers behandeld met medicijnen die ontworpen zijn om het hoofdmechanisme van de schakelaar te blokkeren, waardoor het eiwit effectief wordt uitgezet. Echter, wetenschappers hebben onlangs ontdekt dat er een probleem is: zelfs wanneer het hoofdmechanisme geblokkeerd is, kan het eiwit soms nog steeds signalen doorgeven, wat leidt tot resistentie tegen de medicijnen. Dit gebeurt omdat Btk meer doet dan alleen fungeren als een schakelaar; het fungeert ook als een scaffold (steiger), een structureel platform dat andere eiwitten bij elkaar brengt op het oppervlak van de celcelmembraan om complexe signaleringsprocessen te organiseren.

Een team van onderzoekers van de Colorado State University en de Iowa State University heeft nu een verborgen laag van controle ontdekt over hoe Btk zichzelf organiseert. Ze ontdekten dat de medicijnen die worden gebruikt om deze kankers te behandelen, meer doen dan alleen de enzymatische activiteit van het eiwit te stoppen; ze veranderen ook hoe het eiwit zich op het oppervlak van de cel arrangeert. Door individuele eiwitten te observeren terwijl ze bewegen en clusteren op een modelcelmembraan, ontdekten de wetenschappers dat verschillende medicijnen Btk op totaal verschillende manieren laten gedragen. Sommige medicijnen stimuleren de eiwitten om samen te klonteren in grote, georganiseerde groepen, terwijl andere ze verspreid en uiteengeschoten laten. Deze ontdekking suggereert dat de keuze van het medicijn er niet alleen toe doet voor hoe goed het de hoofdfunctie van het eiwit stopt, maar ook voor hoe het de fysieke structuur van het eiwit en zijn vermogen om als scaffold voor andere cellulaire machinerie te fungeren, vormgeeft.

Om deze onzichtbare processen in actie te zien, creëerden de onderzoekers in een laboratoriumschaal een vereenvoudigde versie van een celmembraan. Ze gebruikten een dunne laag lipiden, de vetmoleculen waaruit celwanden bestaan, en voegden een specifiek type signaalmolecuul toe dat Btk van nature aantrekt. Vervolgens introduceerden ze het Btk-eiwit, dat ze hadden gemarkeerd met een lichtgevende marker zodat ze het onder een speciale microscoop konden volgen. Wanneer ze het eiwit samen met ATP toevoegden, de primaire energiebron van de cel, zagen ze de Btk-eiwitten zich verzamelen op het membraan. In de loop van de tijd bleven deze eiwitten niet alleen daar zitten; ze begonnen grote, zichtbare clusters, of assemblages, te vormen die zich over het oppervlak uitstrekten. Deze clustering is een cruciale stap in de normale werking van Btk, waardoor het kan interageren met andere eiwitten en signalen kan doorgeven.

Het team testte vervolgens of het vermogen van het eiwit om deze clusters te vormen afhankelijk was van zijn hoofdenzymatische activiteit. Ze ontdekten dat het eiwit nog steeds kon assembleren in grote groepen, zelfs wanneer het chemisch werd verhinderd om zijn enzymatische werk uit te voeren. Dit bewees dat het fysieke proces van clusteren losstaat van de chemische reactie die het eiwit gewoonlijk katalyseert. Om te begrijpen wat deze clustering aanstuurt, keken ze naar de specifieke delen van het eiwit die ervoor zorgen dat het aan zichzelf plakt. Ze ontdekten dat twee specifieke regio's van het eiwit met elkaar moeten interageren voordat de clusters kunnen vormen. Als ze deze verbindingen verbroken met behulp van genetische mutaties, bleven de eiwitten verspreid, ongeacht hoeveel energie aanwezig was. Dit bevestigde dat het eiwit vertrouwt op specifieke structurele interfaces om zijn assemblages op te bouwen.

De meest verrassende bevinding kwam toen de onderzoekers verschillende medicijnen testten die ontworpen zijn om Btk te remmen. Ze vergeleken verschillende veelgebruikte medicijnen, waaronder covalente remmers die stevig en permanent binden, en niet-covalente remmers die losser binden. Ze verwachtten dat alle medicijnen simpelweg het werk van het eiwit zouden stoppen. In plaats daarvan zagen ze een splitsing in het gedrag. Medicijnen zoals ibrutinib, acalabrutinib en dasatinib zorgden ervoor dat de Btk-eiwitten grote, dichte clusters vormden op het membraan, net zoals ze dat deden met ATP. In contrast hiermee lieten medicijnen zoals fenebrutinib en pirtobrutinib de eiwitten verspreid en uiteengeschoten achter, ook al blokkeerden deze medicijnen ook succesvol de enzymatische activiteit van het eiwit. Dit betekende dat de medicijnen niet alleen het eiwit uitschakelen; ze vormen actief de manier waarop het eiwit zichzelf op het celoppervlak organiseert.

Om te begrijpen waarom verschillende medicijnen zulke verschillende resultaten veroorzaakten, keken de onderzoekers naar de vorm en flexibiliteit van het eiwit. Ze gebruikten een techniek die meet hoe het eiwit op moleculair niveau "ademt" en beweegt. Ze vonden dat de medicijnen die clustering bevorderden, bepaalde delen van het eiwit flexibeler en opener maakten, met name in de regio's die dienen als dockingplaatsen voor andere eiwitten. Daarentegen maakten de medicijnen die de eiwitten verspreid hielden, diezelfde regio's stijver en geslotener. Dit suggereert dat de medicijnen werken als allosterische regulatoren, wat betekent dat ze aan één deel van het eiwit binden en een verandering in vorm veroorzaken die doorwerkt naar verre delen van het molecuul. Wanneer het eiwit in een flexibele, open staat verkeert, kan het gemakkelijk andere eiwitten grijpen en de grote assemblages op het membraan vormen. Wanneer het in een rigide staat wordt vergrendeld, kan het deze verbindingen niet maken.

De onderzoekers bevestigden dit verder door te testen of andere eiwitten zich aan de Btk-clusters konden hechten. Ze introduceerden een helper-eiwit genaamd Grb2, dat normaal gesproken aan een specifiek deel van Btk bindt om signalen over te dragen. Ze ontdekten dat Grb2 zich gemakkelijk hechtte aan de Btk-clusters die werden gevormd in aanwezigheid van ATP of de clustering-medicijnen. Echter, Grb2 kon zich niet hechten aan de verspreide Btk-eiwitten die werden gevonden in aanwezigheid van de niet-clusterende medicijnen. Dit leverde direct bewijs dat de medicijnen die clustering voorkomen, ook voorkomen dat het eiwit fungeert als een scaffold. Met andere woorden: deze medicijnen doen meer dan alleen de motor uitzetten; ze demonteren het chassis dat de signaleringsmachinerie bij elkaar houdt.

Dit werk onthult een nieuwe manier om naar de functie van kinase-remmers te kijken. Lange tijd lag de focus volledig op de vraag of een medicijn de actieve site van een eiwit kan blokkeren. Deze studie laat zien dat het effect van een medicijn op de algehele vorm van het eiwit en zijn vermogen om zich op het membraan te organiseren even belangrijk is. Verschillende medicijnen die hetzelfde punt targeten, kunnen verschillende fysieke toestanden van het eiwit produceren, wat leidt tot verschillende biologische uitkomsten. Dit onderscheid kan verklaren waarom sommige patiënten resistentie ontwikkelen tegen bepaalde behandelingen terwijl anderen dat niet doen. Als een medicijn het eiwit in een staat laat waarin het nog steeds in staat is om te assembleren en andere signalerende partners te rekruteren, kunnen de kankercellen een manier vinden om de blokkade te omzeilen en door te groeien. De bevindingen suggereren dat de volgende generatie kankertherapieën niet alleen moet kijken naar de chemische inhibitie van een eiwit, maar ook naar hoe dat medicijn de fysieke organisatie van het eiwit en zijn rol als scaffold beïnvloedt.