CRISPR/Cas9-mediated miR-155 knockout suppresses glioblastoma cell proliferation through TP53INP1/p53/p21 activation

Immagina che il tuo corpo sia una città frenetica e che, all'interno di questa città, ogni cellula sia un lavoratore con un compito specifico. A volte, un lavoratore riceve un manuale di istruzioni errato che gli dice di ignorare i segnali di "stop" e di continuare a moltiplicarsi all'infinito. Quando ciò accade nel cervello, crea una folla molto pericolosa e in rapida crescita chiamata glioblastoma. Gli scienziati stanno cercando di capire come fermare questa folla in crescita. Uno degli strumenti che osservano è una minuscola molecola chiamata microRNA. Pensa ai microRNA come agli "editori" o ai "controllori del traffico" della città. Non costruiscono le strade o gli edifici; invece, tengono in mano una cartella clinica e dicono agli altri geni quando lavorare sodo e quando fare una pausa. Un editor specifico, chiamato miR-155, si è comportato come un vigile urbano caotico nei tumori cerebrali, spesso dicendo alle cellule cattive di continuare ad andare, di andare più veloce e di ignorare le regole. Ma gli scienziati non erano del tutto sicuri se fermare questo singolo editor avrebbe effettivamente fermato il tumore, o se il tumore fosse troppo intelligente e potesse semplicemente trovare un altro modo per aggirare l'ostacolo.

In questo studio, i ricercatori hanno deciso di smettere di indovinare e hanno iniziato a editare. Hanno usato uno strumento genetico potente chiamato CRISPR/Cas9, che agisce come un paio di forbici molecolari, per tagliare via permanentemente il gene che produce miR-155 in due diversi tipi di cellule tumorali cerebrali. Volevano vedere cosa succedeva quando queste cellule perdevano il loro "editor caotico" per sempre, piuttosto che solo temporaneamente. Hanno scoperto che quando hanno rimosso con le forbici miR-155, le cellule tumorali non hanno solo rallentato un po'; hanno premuto il freno a fondo. Le cellule hanno smesso di moltiplicarsi così velocemente e hanno iniziato ad attivare un sistema di "auto-controllo" che dice alla cellula di smettere di dividersi. Questo sistema coinvolge una proteina famosa chiamata p53 (spesso chiamata il "guardiano del genoma") e i suoi aiutanti, TP53INP1 e p21. È come se, senza l'editor caotico, le cellule avessero finalmente sentito l'allarme e avessero deciso di sedersi e fare una pausa.

Tuttavia, la storia diventa un po' più interessante perché i due tipi di cellule tumorali testati hanno reagito diversamente allo stesso editing. Mentre entrambi i tipi di cellule hanno smesso di crescere così velocemente, non hanno cambiato la loro "personalità" nello stesso modo. Un tipo di cellula (T98G) sembrava aver perso la capacità di attaccarsi alle cose e di muoversi, mentre l'altro (U87) non ha cambiato molto le sue abitudini di movimento. I ricercatori hanno scoperto che, sebbene rimuovere miR-155 fosse un ottimo modo per fermare la moltiplicazione delle cellule, non fermava completamente il loro essere "cattive" in ogni altro modo, come l'invadere nuovi territori. È come togliere la patente di guida: l'auto smette di avanzare, ma il motore potrebbe ancora ruggire e l'auto potrebbe ancora essere in grado di rotolare un po' se spinta.

La storia delle forbici genetiche

Quindi, cosa hanno fatto esattamente gli scienziati? Hanno preso due famose linee cellulari di tumore cerebrale, chiamate U87 e T98G, e hanno dato loro un restyling permanente usando CRISPR/Cas9. Pensa a queste cellule come a due diversi quartieri nella stessa città. I ricercatori hanno usato le loro forbici molecolari per tagliare via le specifiche istruzioni del DNA per miR-155. Non hanno solo abbassato il volume; hanno rimosso l'intero altoparlante. Hanno creato versioni "knockout" di queste cellule, il che significa che avevano zero miR-155.

Una volta ottenute queste nuove cellule editate, le hanno messe alla prova. Prima, hanno controllato se le cellule fossero ancora vive e felici. La risposta è stata no. Le cellule senza miR-155 avevano molte meno probabilità di sopravvivere e crescere. Quando gli scienziati hanno controllato quante nuove colonie di cellule potevano formarsi, le cellule editate erano molto peggiori di quelle normali nel farlo. Era come se le cellule avessero perso l'ambizione di costruire un nuovo quartiere.

Per capire perché questo stesse accadendo, i ricercatori hanno esaminato i "manuali di istruzioni" interni delle cellule usando una tecnica chiamata sequenziamento dell'RNA. Questo è come leggere ogni singola pagina della biblioteca della cellula per vedere quali libri vengono letti più spesso e quali vengono ignorati. Hanno scoperto che rimuovere miR-155 ha cambiato migliaia di geni. Ma ecco la parte interessante: anche se i due tipi di cellule (U87 e T98G) hanno cambiato le loro biblioteche in modi diversi, entrambi concordavano su una storia principale.

In entrambi i tipi di cellule, la rimozione di miR-155 ha fatto sì che un set specifico di segnali di "stop" si attivasse. I ricercatori hanno scoperto che un gene chiamato TP53INP1 è diventato improvvisamente molto attivo. Pensa a TP53INP1 come a un caposquadra che sveglia il capo, p53. Una volta che p53 è sveglio, chiama un guardia giurata di nome p21. Questa guardia giurata p21 si posiziona davanti al pulsante "accendi motore" della cellula e si rifiuta di lasciare che la cellula si divida. I ricercatori hanno visto che nelle cellule editate, TP53INP1, p53 e p21 stavano tutti lavorando straordinariamente. Hanno anche notato che le cellule hanno iniziato a produrre più un "segnale di suicidio" (Bax) e meno un "segnale di sopravvivenza" (Bcl-2), rendendo le cellule più fragili e meno propense a sopravvivere.

Il colpo di scena: non tutte le cellule sono uguali

Mentre il segnale di "stop alla crescita" era costante in entrambi i tipi di cellule, gli altri cambiamenti sono stati un miscuglio. I ricercatori volevano sapere se rimuovere miR-155 avrebbe anche fermato le cellule dal essere "maligne" — ovvero, le cellule avrebbero smesso di essere in grado di invadere nuove aree o di agire come cellule staminali?

I risultati sono stati un po' sorprendenti. Nelle cellule T98G, rimuovere miR-155 ha fatto perdere loro molti dei tratti da "cattivi". Producevano meno proteine che aiutano a muoversi e cambiare forma (come Twist, Snail e Vimentin). Era come se le cellule T98G avessero improvvisamente deciso di essere più simili a cittadini normali e tranquilli. Tuttavia, le cellule U87 non sono cambiate molto in questo senso. Mantenevano ancora molte delle loro proteine da "cattivi", con solo una (TWIST) che mostrava un calo evidente.

Quando hanno testato quanto bene le cellule potessero muoversi e invadere, i risultati sono stati di nuovo un po' disomogenei. Entrambi i tipi di cellule si muovevano un po' più lentamente, ma le cellule T98G non hanno smesso affatto di invadere, mentre le cellule U87 lo hanno fatto. Ciò suggerisce che, sebbene rimuovere miR-155 sia un modo potente per fermare la moltiplicazione delle cellule, non risolve automaticamente ogni altro problema che il tumore ha. Le cellule potrebbero ancora essere in grado di infilarsi in nuovi spazi, anche se non crescono così velocemente.

Cosa significa per il quadro generale

Il messaggio principale di questo studio è che miR-155 è un protagonista chiave nel mantenere queste cellule tumorali cerebrali impegnate e in crescita. Quando lo rimuovi permanentemente, le cellule premono il freno a fondo perché attivano un potente sistema di "stop" che coinvolge TP53INP1, p53 e p21. Questo è un grande passo avanti perché dimostra che colpire questa specifica molecola potrebbe essere un modo per rallentare il tumore.

Tuttavia, lo studio suggerisce anche che non è una bacchetta magica che risolve tutto. Le cellule non si sono comportate tutte allo stesso modo e non hanno perso tutta la loro capacità di essere pericolose. I ricercatori hanno notato che i loro esperimenti sono stati condotti in una piastra di laboratorio, senza l'ambiente complesso di un vero corpo umano (come il sistema immunitario). Quindi, sebbene i risultati siano molto promettenti per comprendere come funzionano queste cellule, sono solo il primo passo. Lo studio suggerisce che, se vogliamo usare questa conoscenza per trattare i pazienti, potremmo doverla combinare con altri trattamenti per gestire le parti del tumore che non hanno smesso di muoversi.

In breve, gli scienziati hanno usato le forbici genetiche per tagliare via un editor caotico, e il risultato è stato che le cellule tumorali hanno finalmente ascoltato i segnali di "stop". Ma proprio come nella vita reale, fermare la crescita è solo parte della battaglia; le cellule hanno ancora alcuni trucchi sotto la manica, e gli scienziati dovranno continuare a lavorare per capire come fermare anche quelli.