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Evaluate the performance of Targeted Sequencing for Tumor FFPE Samples and ctDNA Standards on the Sikun 2000

Questo studio dimostra che la piattaforma di sequenziamento Sikun 2000 offre metriche di qualità superiori, un'elevata riproducibilità e una sensibilità potenziata per il rilevamento di varianti a bassa frequenza in campioni tumorali FFPE e standard di ctDNA rispetto alle consolidate piattaforme Illumina, affermandosi come un'alternativa competitiva per applicazioni cliniche e di ricerca.

Autori originali: Jiuzhou Zhao, Tianbo Wang, Li Zhao, Jiawen Zheng, Chengzhi Zhao, Junnan Feng, Rui Sun, Chengjiao Duan, Dongdong Chen, Keya Cai, Bing Wei

Pubblicato 2026-08-06

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CC BY 4.0

Autori originali: Jiuzhou Zhao, Tianbo Wang, Li Zhao, Jiawen Zheng, Chengzhi Zhao, Junnan Feng, Rui Sun, Chengjiao Duan, Dongdong Chen, Keya Cai, Bing Wei

Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). ⚕️ Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo

Immaginate il corpo umano come una città enorme e frenetica. A volte, alcuni edifici in quella città iniziano a malfunzionare e a trasformarsi in punti critici: questi sono i tumori. Per fermarli, i medici hanno bisogno di una mappa che indichi esattamente cosa sia andato storto all'interno delle cellule. Per molto tempo, l'unico modo per ottenere questa mappa è stato quello di inviare una squadra con una pala per scavare e prelevare un pezzo dell'edificio danneggiato (una biopsia tissutale). Ma a volte, l'edificio è troppo difficile da raggiungere, o il danno è troppo piccolo per essere visto con una pala.

Entra in scena la "biopsia liquida". Invece di scavare, i medici possono cercare minuscoli frammenti galleggianti della planimetria dell'edificio che i punti critici hanno accidentalmente lasciato cadere nel flusso sanguigno della città. Questi frammenti sono chiamati ctDNA. Il problema è che questi scarti sono incredibilmente rari e fragili, come cercare un singolo granello di sabbia specifico su una spiaggia. Per trovarli, gli scienziati utilizzano una macchina ad alta tecnologia chiamata Next-Generation Sequencer (NGS). Pensate a questa macchina come a una fotocopiatrice super veloce e ultra-precisa che legge il codice genetico. L'obiettivo è rendere la macchina non solo veloce e accurata, ma anche accessibile, affinché più persone possano ottenere queste mappe salvavita.

Questo articolo è un pagella per una nuova fotocopiatrice chiamata Sikun 2000, prodotta da un'azienda chiamata Sikun Life Science. I ricercatori volevano vedere se questa nuova macchina potesse fare il lavoro altrettanto bene o anche meglio delle famose macchine "gold standard" attualmente in uso (come la serie Illumina NextSeq 550 e NovaSeq). Hanno testato il Sikun 2000 su due cose: campioni reali di tumore prelevati dai pazienti (campioni FFPE) e campioni di "pratica" con quantità minuscole e note di mutazioni (standard di ctDNA).

Ecco cosa hanno scoperto:

Il Test del Mondo Reale (Campioni Tumorali)
Il team ha preso 50 campioni tumorali reali e li ha analizzati sia con il nuovo Sikun 2000 che con l'established NextSeq 550. Volevano vedere se la nuova macchina potesse leggere il codice genetico chiaramente e trovare gli stessi errori della vecchia.

Il Risultato: Il Sikun 2000 ha fatto un ottimo lavoro. Ha prodotto "foto" del codice genetico più chiare e nitide, con un punteggio di qualità superiore (chiamato Q30) rispetto al NextSeq 550. È riuscito anche a leggere le parti uniche del codice in modo più profondo (maggiore profondità unica), il che è fondamentale per individuare errori rari.
L'Abbinamento: Quando hanno confrontato le liste di mutazioni trovate dalle due macchine, queste concordavano su quasi tutto (circa il 96% delle volte). Anche le misurazioni di quanto fosse comune una mutazione (VAF) erano quasi identiche. Ciò suggerisce che il Sikun 2000 sia un sostituto affidabile delle macchine più vecchie quando si esamina il tessuto reale dei pazienti.

Il Test "Ago nel Pagliaio" (Standard di ctDNA)
Successivamente, hanno testato la capacità della macchina di trovare mutazioni molto rare. Hanno utilizzato campioni con "rotelle di allenamento" (standard) che contenevano mutazioni note a livelli molto bassi: 0,1% e 1,0%. Trovare una mutazione dello 0,1% è come trovare un particolare granello di sabbia rosso in un secchio di mille granelli bianchi.

Il Risultato: Il Sikun 2000 è stato un campione in questo. Ha trovato il 100% delle mutazioni nei campioni dello 0,1% e dell'1,0%.
Il Confronto: Quando hanno confrontato il Sikun 2000 con altre due macchine di alto livello, Illumina NovaSeq 6000 e NovaSeq X, il Sikun 2000 è risultato leggermente superiore. Ha trovato tutte le 8 mutazioni attese nel difficile campione dello 0,1%, mentre le altre due macchine ne hanno persa una (la mutazione KRAS A146T). Il Sikun 2000 ha anche prodotto meno letture "sfocate" o di bassa qualità, il che significa che i suoi dati erano più puliti.

Cosa Significa Questo
L'articolo suggerisce che il Sikun 2000 sia un forte contendente nel mondo della genetica del cancro. Offre dati di alta qualità che eguagliano o superano le attuali macchine di fascia alta, specialmente quando si cerca di individuare mutazioni molto rare nelle biopsie liquide. Gli autori osservano che, sebbene la macchina sia ottima per il sequenziamento mirato (osservare geni specifici), potrebbe non essere la scelta migliore per progetti massicci di intero genoma a causa dei suoi limiti di output. Tuttavia, per il compito specifico di trovare mutazioni del cancro nei campioni dei pazienti, il Sikun 2000 mostra un potenziale significativo per essere uno strumento competitivo, di alta qualità e conveniente, sia per la ricerca che per l'uso clinico.

Sintesi Tecnica: Valutazione del sequenziamento mirato per campioni FFPE tumorali e standard di ctDNA su Sikun 2000

Definizione del problema
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è diventato lo standard per la rilevazione delle varianti geniche tumorali per guidare l'oncologia di precisione. Tuttavia, con l'espandersi della scala di sequenziamento, vi è una crescente domanda di piattaforme che offrano sia un'elevata qualità dei dati che costi inferiori. Sebbene le piattaforme Illumina (ad esempio, NextSeq 550, NovaSeq 6000) rimangano lo standard prevalente, stanno emergendo alternative nazionali. Il Sikun 2000, una nuova piattaforma di sequenziamento basata sul sequenziamento per sintesi (SBS) con un approccio a terminatore reversibile, è stato lanciato per la ricerca scientifica. Esso dichiara la compatibilità con le librerie Illumina, un'alta accuratezza, una buona ripetibilità e costi operativi inferiori. Tuttavia, le sue prestazioni rispetto alle consolidate piattaforme Illumina nelle applicazioni tumorali cliniche — specificamente per i campioni di tessuto FFPE e il DNA tumorale circolante (ctDNA) a bassa frequenza — richiedevano una valutazione rigorosa.

Metodologia
Lo studio ha impiegato un disegno sperimentale comparativo per valutare il Sikun 2000 rispetto alle consolidate piattaforme Illumina (NextSeq 550, NovaSeq 6000 e NovaSeq X).

Preparazione dei campioni:
- Campioni FFPE: 50 campioni FFPE tumorali provenienti da pazienti oncologici sono stati processati utilizzando un protocollo standardizzato di estrazione del DNA e costruzione della libreria (Burning Rock Lung Plasma® Multi-Gene Mutation Detection Kit con un pannello di 168 geni).
- Standard di ctDNA: Standard di ctDNA per il tumore al polmone con frequenze di allele variante (VAF) note dello 0,0% (controllo negativo), 0,1% e 1,0% sono stati preparati utilizzando il kit IGT® Fast Library Prep e le sonde TargetSeq® (pannello NSCLS 23 geni).
Sequenziamento:
- I campioni FFPE sono stati sottoposti a sequenziamento in triplicato sul Sikun 2000 e a sequenziamento singolo sul NextSeq 550.
- Gli standard di ctDNA sono stati sequenziati su Sikun 2000, NovaSeq 6000 e NovaSeq X.
- Tutte le piattaforme hanno utilizzato un sequenziamento paired-end a 150 bp (PE150).
Elaborazione e analisi dei dati:
- I dati grezzi sono stati sottoposti a downsampling a profondità equivalenti per un confronto equo.
- Il controllo qualità ha incluso il filtraggio per contaminazione da adattatori, basi a bassa qualità e contenuto di N.
- Le letture sono state allineate al genoma di riferimento h19 utilizzando BWA-MEM.
- Il variant calling (SNV, Indel) è stato eseguito tramite VarScan, seguito da annotazione con ANNOVAR e SnpEff.
- Sono stati utilizzati test statistici (test del rango segno Wilcoxon, ANOVA a una via, correlazione di Pearson) per confrontare le metriche di qualità (Q30, profondità unica, rapporto di mappatura) e la concordanza nella rilevazione delle varianti.

Contributi chiave e risultati

Prestazioni sui campioni FFPE (Sikun 2000 vs. NextSeq 550):
- Metriche di qualità: Il Sikun 2000 ha dimostrato prestazioni superiori in termini di profondità di sequenziamento unica e rapporti Q30 rispetto al NextSeq 550. Il rapporto Q30 per Sikun 2000 variava dal 95,6% al 97,5%, significativamente più alto dell'88,8%–95,9% del NextSeq 550 ( $P < 0,01$ ). Anche la profondità unica è stata significativamente più alta per Sikun 2000 ( $P < 0,01$ ).
- Riproducibilità: Il sequenziamento in triplicato su Sikun 2000 ha mostrato un'alta riproducibilità, con le curve dei parametri qualitativi chiave che esibiscono un alto grado di sovrapposizione.
- Concordanza delle varianti: Entrambe le piattaforme hanno mostrato un'elevata consistenza nella rilevazione delle varianti dei geni driver (EGFR, ALK, KRAS, ecc.) nel NSCLC, con un tasso di concordanza del 95,83%. Le frequenze di allele variante (VAF) di SNV e Indel hanno mostrato una forte correlazione ( $R^2 \geq 0,96$ ) tra le due piattaforme.
Prestazioni sugli standard di ctDNA (Sikun 2000 vs. NovaSeq 6000/X):
- Sensibilità: Per gli standard di ctDNA con VAF dello 0,1% e dell'1,0%, il Sikun 2000 ha raggiunto il 100% di sensibilità di rilevazione per tutti gli 8 siti di mutazione.
- Sensibilità comparativa: Al livello di VAF dello 0,1%, il Sikun 2000 ha superato il NovaSeq 6000 e il NovaSeq X. Mentre il Sikun 2000 ha rilevato tutti gli 8 siti, le piattaforme NovaSeq ne hanno rilevati solo l'87,5% (non riuscendo a rilevare la SNV KRAS p.A146T).
- Qualità dei dati: Il Sikun 2000 ha generato significativamente meno letture a bassa qualità (0,05%) rispetto a NovaSeq 6000 (0,65%) e NovaSeq X (0,86%) ( $P < 0,05$ ). Ha inoltre raggiunto una profondità target media più elevata (28.355×) rispetto alle piattaforme NovaSeq.

Significatività e rivendicazioni
L'articolo sostiene che il Sikun 2000 rappresenti un'alternativa competitiva per il sequenziamento mirato del tumore sia nella ricerca scientifica che nelle applicazioni cliniche. Lo studio conclude che il Sikun 2000 offre:

Qualità dei dati superiore: Rapporti Q30 e profondità uniche più elevati rispetto al NextSeq 550 nei campioni FFPE.
Migliore rilevazione a bassa frequenza: Sensibilità superiore per le varianti a bassa frequenza (VAF 0,1%) rispetto alle piattaforme Illumina NovaSeq ad alto throughput, attribuita a tassi inferiori di letture a bassa qualità e a una maggiore profondità target.
Alta riproducibilità: Risultati coerenti attraverso saggi ripetuti.
Efficacia dei costi: Gli autori rilevano che la piattaforma presenta costi di esercizio significativamente inferiori rispetto alle piattaforme Illumina, suggerendo una forte competitività sul mercato.

Gli autori posizionano il Sikun 2000 come un'opzione valida per la medicina di precisione, in particolare per la rilevazione delle varianti dei geni driver nel NSCLC e il monitoraggio del ctDNA, pur riconoscendo che un'adozione clinica più ampia richiederà ulteriori validazioni con dataset di campioni clinici più ampi.

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