An RPA-CRISPR-Cas12a-Based Fluorescence and Lateral Flow Assay for the Detection of Ureaplasma urealyticum

Negli angoli silenziosi del corpo umano, specificamente all'interno dell'apparato urogenitale, un microrganismo microscopico chiamato Ureaplasma urealyticum vive spesso inosservato. Per molti, non causa alcun problema, ma per altri agisce come un invasore opportunista, portando a infiammazioni dolorose, infezioni che non rispondono ai trattamenti standard e complicazioni durante la gravidanza. Rilevare questo minuscolo patogeno è stato a lungo una lotta per i medici. I metodi tradizionali richiedono la crescita dei batteri in un laboratorio, un processo che può richiedere giorni e spesso manca completamente il bersaglio. Altre tecniche, che cercano il codice genetico del microrganismo, sono più veloci e accurate ma richiedono macchine costose e complesse che esistono solo in laboratori ben equipaggiati. Questo divario tra ciò che è necessario e ciò che è disponibile lascia molti pazienti senza una diagnosi rapida o affidabile, specialmente nelle cliniche comunitarie o nelle aree remote dove le risorse sono scarse.

Gli scienziati hanno lavorato per colmare questo divario combinando due potenti strumenti biologici. Il primo è un metodo che crea copie di un pezzo specifico di materiale genetico, agendo come una fotocopiatrice per il DNA, ma che funziona a una temperatura costante e calda piuttosto che richiedere i rapidi cicli di riscaldamento e raffreddamento delle macchine tradizionali. Il secondo strumento è un sistema molecolare derivato dalle difese immunitarie dei batteri, che agisce come un motore di ricerca altamente preciso. Una volta che questo sistema trova il suo bersaglio specifico, attiva una potente capacità di taglio che può essere vista a occhio nudo o misurata con un semplice rilevatore di luce. Intrecciando queste due tecnologie, i ricercatori hanno creato un nuovo modo per trovare l'Ureaplasma urealyticum che è veloce, sensibile e non richiede un laboratorio pieno di attrezzature costose.

Un team di ricercatori presso il Secondo Ospedale dell'Università Medica di Hebei, in Cina, ha recentemente messo alla prova questa idea. Hanno progettato un processo in due fasi per dare la caccia alla firma genetica dei batteri. Per prima cosa, hanno preso un campione e hanno utilizzato il metodo di copia per moltiplicare qualsiasi DNA dei batteri target presenti nel fluido. Questo passaggio ha richiesto circa venti minuti e si è svolto a un calore costante e mite. Una volta amplificato il materiale genetico, hanno introdotto il secondo strumento: un complesso proteico guidato da una specifica molecola di RNA. Questo complesso era programmato per riconoscere solo il DNA copiato dai batteri. Se i batteri erano presenti, il complesso si agganciava al bersaglio e iniziava immediatamente a tagliare una speciale molecola reporter che galleggiava nella soluzione.

I ricercatori hanno costruito due modi diversi per vedere il risultato di questo taglio. Il primo metodo utilizzava un reporter fluorescente, una molecola che brilla quando viene tagliata. Quando i batteri erano presenti, l'azione di taglio separava la parte luminosa dal suo partner scuro, facendo illuminare la soluzione. Questa versione del test era incredibilmente sensibile, capace di rilevare appena tre copie del materiale genetico batterico in una singola goccia di liquido. Il secondo metodo è stato progettato per i luoghi privi di elettricità o macchinari. Qui, la molecola reporter era attaccata a una minuscola particella d'oro e posizionata su una striscia di carta, simile a un test di gravidanza domestico. Se i batteri erano presenti, l'azione di taglio rilasciava le particelle d'oro, che poi viaggiavano lungo la striscia e formavano una visibile linea rossa. Questa versione visiva era leggermente meno sensibile, rilevando circa sessantasei copie per goccia, ma non richiedeva strumenti per leggere il risultato.

Per garantire l'affidabilità del test, il team ha verificato se avrebbe scambiato altre infezioni comuni per i batteri bersaglio. Hanno testato campioni contenenti quattro diversi tipi di patogeni urogenitali, inclusi quelli che causano gonorrea e clamidia. Il nuovo test è rimasto silente per tutti loro, dimostrando che non avrebbe attivato un falso allarme. I ricercatori hanno poi preso trenta campioni reali da pazienti e hanno confrontato il loro nuovo metodo con un test commerciale standard utilizzato negli ospedali. I risultati sono stati un match perfetto; il nuovo sistema ha identificato ogni caso positivo e ogni caso negativo esattamente come faceva il metodo standard.

L'intero processo, dall'aggiunta del campione alla visione del risultato, ha richiesto tra i trentacinque e i cinquanta minuti. Questo è un miglioramento significativo rispetto ai giorni richiesti per la coltura batterica e alle attrezzature specializzate necessarie per il test genetico standard. La capacità di eseguire questo test utilizzando solo un semplice riscaldatore e, nella versione visiva, nessun macchinario affatto, suggerisce una nuova via per diagnosticare infezioni difficili in contesti dove la tecnologia avanzata non è disponibile. Dimostrando che questa combinazione di copia e taglio funziona così bene per l'Ureaplasma urealyticum, i ricercatori hanno mostrato che la diagnosi rapida e accurata può essere portata fuori dal laboratorio ad alta tecnologia e nelle mani dei clinici ovunque.