An RPA-CRISPR-Cas12a-Based Fluorescence and Lateral Flow Assay for the Detection of Ureaplasma urealyticum

In de stille hoekjes van het menselijk lichaam, specif으로 binnen het urogenitale kanaal, leeft vaak een microscopisch organisme genaamd Ureaplasma urealyticum onopgemerkt. Voor velen veroorzaakt het geen problemen, maar voor anderen fungeert het als een opportunistische indringer, wat leidt tot pijnlijke ontstekingen, infecties die niet reageren op standaardbehandelingen en complicaties tijdens de zwangerschap. Het detecteren van deze kleine pathogeen is lang een strijd geweest voor artsen. Traditionele methoden vereisen het kweken van de bacterie in een laboratorium, een proces dat dagen kan duren en vaak het doel volledig mist. Andere technieken, die zoeken naar de genetische code van de ziekteverwekker, zijn sneller en nauwkeuriger maar vereisen dure, complexe machines die alleen in goed uitgeruste laboratoria aanwezig zijn. Deze kloof tussen wat nodig is en wat beschikbaar is, laat veel patiënten zonder een snelle of betrouwbare diagnose, vooral in klinieken in de gemeenschap of afgelegen gebieden waar de middelen schaars zijn.

Wetenschappers hebben geprobeerd deze kloof te overbruggen door twee krachtige biologische hulpmiddelen te combineren. De eerste is een methode die kopieën maakt van een specifiek stuk genetisch materiaal, werkend als een fotokopieerapparaat voor DNA, maar één die werkt bij een constante, warme temperatuur in plaats van de snelle verwarmings- en afkoelingscycli van traditionele machines te vereisen. Het tweede hulpmiddel is een moleculair systeem afgeleid van de immuunverdediging van bacteriën, dat werkt als een zeer nauwkeurige zoekmachine. Zodra dit systeem zijn specifieke doelwit vindt, schakelt het over op een krachtig snijvermogen dat met het blote oog kan worden gezien of gemeten door een eenvoudige lichtdetector. Door deze twee technologieën in elkaar te weven, hebben onderzoekers een nieuwe manier gecreëerd om Ureaplasma urealyticum te vinden die snel, gevoelig en niet afhankelijk is van een laboratorium vol dure apparatuur.

Een team van onderzoekers aan het Tweede Ziekenhuis van de Hebei Medische Universiteit in China heeft dit idee onlangs op de proef gesteld. Ze ontwierpen een tweestaps proces om de genetische signatuur van de bacterie op te sporen. Eerst namen ze een monster en gebruikten ze de kopieermethode om de aanwezige DNA van de doelbacterie in de vloeistof te vermenigvuldigen. Deze stap duurde ongeveer twintig minuten en vond plaats bij een constante, milde warmte. Zodra het genetische materiaal was geamplificeerd, introduceerden ze het tweede hulpmiddel: een eiwitcomplex geleid door een specifiek RNA-molecuul. Dit complex was geprogrammeerd om alleen het gekopieerde DNA van de bacteriën te herkennen. Als de bacteriën aanwezig waren, vergrendelde het complex zich op het doelwit en begon het onmiddellijk door een speciaal reportermolecuul te snijden dat in de oplossing zweefde.

De onderzoekers bouwden twee verschillende manieren om het resultaat van dit snijden te zien. De eerste methode gebruikte een fluorescente reporter, een molecuul dat oplicht wanneer het wordt doorgeknipt. Wanneer de bacteriën aanwezig waren, scheidde de snijactie het lichtgevende deel van zijn donkere partner, waardoor de oplossing oplichtte. Deze versie van de test was ongelooflijk gevoelig en kon zelfs slechts drie exemplaren van het bacteriële genetische materiaal in een enkele druppel vloeistof detecteren. De tweede methode was ontworpen voor plaatsen zonder elektriciteit of machines. Hier werd het reportermolecuul aan een klein gouddeeltje bevestigd en op een papieren strip geplaatst, vergelijkbaar met een zwangerschapstest voor thuis. Als de bacteriën aanwezig waren, liet de snijactie de gouddeeltjes los, die vervolgens over de strip reisden en een zichtbare rode lijn vormden. Deze visuele versie was iets minder gevoelig en detecteerde ongeveer zesentachtig exemplaren per druppel, maar vereiste geen instrumenten om het resultaat af te lezen.

Om ervoor te zorgen dat de test betrouwbaar was, controleerde het team of de test andere veelvoorkomende infecties voor de doelbacterie zou aanzien. Ze testten monsters met vier verschillende soorten urogene pathogenen, waaronder die gonorroe en chlamydia veroorzaken. De nieuwe test bleef stil voor al deze infecties, wat aantoonde dat de test geen vals alarm zou geven. De onderzoekers namen vervolgens dertig echte monsters van patiënten en vergeleken hun nieuwe methode met een standaard commerciële test die in ziekenhuizen wordt gebruikt. De resultaten waren een perfecte match; het nieuwe systeem identificeerde elke positieve en elke negatieve casus exact zoals de standaardmethode dat deed.

Het gehele proces, van het toevoegen van het monster tot het zien van het resultaat, duurde tussen de vijfendertig en vijftig minuten. Dit is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de dagen die nodig zijn voor bacteriële kweek en de gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor standaard genetische tests. Het vermogen om deze test uit te voeren met alleen een eenvoudige verwarmer en, in het geval van de visuele versie, helemaal geen machines, suggereert een nieuwe weg voor het diagnosticeren van moeilijke infecties in omgevingen waar geavanceerde technologie niet beschikbaar is. Door te bewijzen dat deze combinatie van kopiëren en snijden zo goed werkt voor Ureaplasma urealyticum, hebben de onderzoekers aangetoond dat snelle, nauwkeurige diagnose uit het hoogtechnologische lab naar de handen van clinici overal gebracht kan worden.