Real-time label-free wide-field super-resolution microscopy via fast high-spatial‑frequency scanning illumination

Per oltre un secolo, i microscopi ottici hanno permesso agli scienziati di scrutare nel mondo nascosto di cellule e materiali, eppure hanno sempre affrontato un ostacolo ostinato. Questa barriera, nota come limite di diffrazione, stabilisce che, indipendentemente dalla perfezione della lente, la luce non può essere focalizzata abbastanza strettamente da rivelare dettagli più piccoli di metà della lunghezza d'onda della luce utilizzata. Immaginate di cercare di vedere la grana fine di un tavolo di legno attraverso una fitta nebbia; le onde luminose si confondono, fondendo caratteristiche distinte in una singola, indistinta macchia. Per i ricercatori biologici, questo ha significato che molte strutture minuscole all'interno degli esseri viventi sono rimaste invisibili a meno che non venissero colorate con sostanze chimiche fluorescenti brillanti e spesso tossiche. Questi coloranti agiscono come segnali artificiali, ma possono danneggiare le stesse cellule che gli scienziati desiderano studiare e non possono essere utilizzati su oggetti non viventi come chip per computer o campioni geologici. La ricerca di un modo per vedere questi piccoli dettagli senza usare coloranti o danneggiare il campione è stata a lungo il santo graal nel campo dell'imaging.

Un team di ricercatori della Chongqing University e di altre istituzioni ha ora sviluppato un nuovo modo per superare questa barriera, offrendo un metodo per vedere l'invisibile senza la necessità di etichette chimiche. Chiamano la loro tecnica microscopia a super-risoluzione con illuminazione a scansione high-k. Invece di cercare di costringere un fascio di luce standard a focalizzarsi più strettamente, il che la fisica dice essere impossibile, hanno cambiato il modo in cui la luce colpisce il campione. Hanno creato un cerchio speciale di luce che, quando focalizzato, trasporta un alto livello di dettaglio spaziale. Scansionando rapidamente questo fascio a forma di anello attraverso un campione, possono spostare le informazioni sulle strutture minuscole in un intervallo che la telecamera del microscopio può effettivamente rilevare. Il risultato è un'immagine chiara e in tempo reale di caratteristiche molto più piccole della lunghezza d'onda della luce stessa, ottenuta senza danneggiare il campione o richiedere una complessa ricostruzione dei dati.

I ricercatori hanno iniziato dimostrando che questo approccio era teoricamente solido attraverso simulazioni al computer. Hanno modellato il modo in cui un fascio di luce, modellato in un cono cavo, interagisce con un campione. In un microscopio standard, la luce viaggia verticalmente verso il basso e la lente può catturare solo la luce dispersa che rimbalza entro un certo angolo. Questo limita la visione a caratteristiche più grandi. Tuttavia, quando la luce viene modellata in un anello e focalizzata, colpisce il campione da molteplici angoli simultaneamente. Questo approccio angolato permette al microscopio di catturare dettagli che normalmente andrebbero persi. Le simulazioni hanno dimostrato che questo metodo può effettivamente raddoppiare la potenza risolutiva del microscopio, permettendogli di distinguere caratteristiche che sono la metà delle dimensioni di ciò che una lente convenzionale potrebbe vedere.

Per trasformare questa teoria in realtà, il team ha costruito un sistema di microscopia personalizzato utilizzando un laser che emette luce a una lunghezza d'onda di 405 nanometri. Hanno fatto passare questo laser attraverso una coppia di speciali coni di vetro chiamati axicon per trasformare il fascio in un anello luminoso e sottile. Questo anello è stato poi proiettato sulla parte posteriore di una lente microscopica ad alta potenza. Mentre l'anello si focalizzava sul campione, creava un piccolo e intenso punto di luce che possedeva gli alti dettagli di frequenza necessari per vedere le piccole strutture. Per evitare le immagini sfocate e rumorose che spesso derivano dall'uso di un singolo fascio costante, hanno collegato uno specchio a movimento rapido al sistema. Questo specchio scansionava l'anello di luce focalizzato avanti e indietro attraverso il campione migliaia di volte al secondo. Poiché la telecamera catturava l'immagine mentre la luce si muoveva così velocemente, la foto finale appariva come un'immagine fluida e chiara, libera dalle interferenze che solitamente affliggono un lavoro di tale precisione.

Il team ha testato il nuovo microscopio su una serie di modelli incisi su un chip di silicio. Questi modelli includevano griglie di linee incredibilmente sottili, con una larghezza di soli 70 nanometri, e spazi tra le linee piccoli quanto 25 nanometri. Sotto un microscopio standard che utilizza la stessa lente, queste linee apparivano come una singola, sfocata macchia grigia; i dettagli erano completamente persi. Quando i ricercatori hanno attivato il loro nuovo sistema di scansione, i risultati sono stati sorprendenti. Le linee da 70 nanometri apparivano come creste distinte e nitide, e gli spazi di 25 nanometri tra di esse erano chiaramente visibili. Hanno anche testato il sistema su forme più complesse, inclusi disegni di un hot pot, una lanterna e un panda, tutti realizzati con linee larghe solo 50 nanometri. Mentre il microscopio standard mostrava solo vaghi schizzi, il nuovo sistema rivelava i dettagli intricati di ogni forma con una chiarezza straordinaria.

Uno dei successi più significativi di questo lavoro è la capacità di mantenere questo alto livello di dettaglio su un'ampia area. Molte tecniche di super-risoluzione possono vedere solo una piccola porzione di un campione alla volta, richiedendo all'utente di unire centinaia di immagini per vedere l'intera immagine. Questo nuovo metodo, invece, ha catturato un ampio campo visivo di 110 per 110 micrometri pur risolvendo linee sottili quanto 85 nanometri. Ciò significa che il microscopio può scansionare un'ampia area in tempo reale, fornendo un contesto ampio per i minuscoli dettagli che rivela. La velocità dell'imaging è limitata solo dalla velocità con cui la telecamera può scattare foto, rendendolo adatto all'osservazione di processi dinamici mentre accadono.

Per dimostrare che questa tecnica funziona sul tessuto biologico vivente, i ricercatori si sono rivolti a campioni di rene di topo. Si sono concentrati sul glomerulo, un'unità di filtraggio minuscola del rene che contiene una rete di strutture delicate chiamate intervalli mesangiali. Questi intervalli sono così piccoli che sono difficili da distinguere senza una speciale colorazione. Utilizzando il loro sistema privo di etichette, il team è stato in grado di immagini il tessuto renale direttamente. Le immagini risultanti hanno mostrato i vuoti fini e stretti tra le cellule mesangiali con una chiarezza che la microscopia standard non poteva eguagliare. I profili di intensità delle immagini hanno confermato che il sistema poteva distinguere questi intervalli estremamente piccoli, che erano completamente invisibili nelle immagini convenzionali. Ciò dimostra che il metodo può rivelare l'architettura fine del tessuto vivente senza la necessità di alcun colorante o marcatore chimico.

I ricercatori sottolineano che il loro approccio offre una via semplice e diretta verso l'imaging a super-risoluzione. A differenza di altri metodi che dipendono da complessi algoritmi matematici per ricostruire le immagini o richiedono una luce intensa che può danneggiare le cellule, questa tecnica utilizza le proprietà fisiche della scansione della luce per ottenere il risultato. Funziona sia per i campioni biologici che per gli oggetti non biologici, come i microchip utilizzati nell'elettronica. Eliminando la necessità di etichette fluorescenti, apre la porta allo studio dei campioni nel loro stato naturale, liberi dalle distorsioni o dalla tossicità che i coloranti possono introdurre. Il lavoro suggerisce una nuova strada per la microscopia, dove la capacità di vedere i dettagli più piccoli non è più vincolata dai limiti tradizionali della luce, a patto che la luce sia guidata correttamente.