Real-time label-free wide-field super-resolution microscopy via fast high-spatial‑frequency scanning illumination

一个多世纪以来，光学显微镜让科学家得以窥见细胞和材料的隐藏世界，但它们始终面临着一道顽固的墙。这道被称为“衍射极限”的障碍规定，无论透镜多么完美，光线都无法被聚焦得足够紧凑，以揭示小于所用光波长一半的细节。想象一下，试图透过浓雾观察木桌的细腻纹理；光波会相互融合，将清晰的特征变成一个模糊且不清晰的斑块。对于生物研究人员来说，这意味着许多生物体内部的微小结构除非使用明亮的、通常具有毒性的荧光化学物质进行染色，否则将保持不可见。这些染料充当了人工信标，但它们可能会损伤科学家想要研究的细胞本身，且无法用于计算机芯片或地质样本等非生物物体。寻找无需使用染料或损坏样本即可观察这些微小细节的方法，长期以来一直是成像领域追求的圣杯。

重庆大学及其它机构的研究团队现在开发出了一种突破这一障碍的新方法，提供了一种无需化学标记即可观察不可见物体的手段。他们将这种技术称为“高k值扫描照明超分辨率显微术”。他们并没有尝试强行让标准光束聚焦得更紧（物理学证明这是不可能的），而是改变了光线照射样本的方式。他们创造了一个特殊的环形光束，当该光束聚焦时，能够携带高水平的空间细节。通过在样本上快速扫描这个环状光束，他们可以将关于微小结构的信息转移到显微镜相机实际上可以检测到的范围内。其结果是，在无需复杂数据重建或损坏样本的情况下，实现了对远小于光波长本身的特征的清晰实时成像。

研究人员首先通过计算机模拟证明了这种方法在理论上是成立的。他们模拟了一个形状为中空圆锥的光束与样本相互作用的过程。在标准显微镜中，光线垂直向下传播，透镜只能捕捉反射回来的一定角度内的散射光。这限制了视野仅能看到较大的特征。然而，当光被塑造成环形并聚焦时，它会从许多不同的角度同时照射样本。这种倾斜入射的方法使显微镜能够捕捉到通常会丢失的细节。模拟显示，这种方法可以有效地将显微镜的分辨能力提高一倍，使其能够区分出仅为传统透镜所能见尺寸一半的特征。

为了将理论转化为现实，团队使用一台发射405纳米波长激光的定制显微镜系统构建了实验。他们让激光通过一对被称为“阿西科恩”（axicons）的特殊玻璃锥，将光束转化为一个细窄且明亮的圆环。随后，这个圆环被投影到高功率显微镜透镜的背面。当圆环聚焦在样本上时，它产生了一个极其微小且强烈的亮点，该亮点拥有观察微小结构所需的高频细节。为了避免使用单一稳定光束经常产生的模糊和噪声图像，他们在系统中安装了一个快速移动的镜片。这个镜片以每秒数千次的频率在样本上前后扫描聚焦的环形光。由于相机是在光线快速移动时捕捉图像的，最终呈现出的图像平滑且清晰，没有通常困扰此类高精度工作的干涉图案。

团队在硅片上刻蚀的一系列测试图案上测试了他们的新显微镜。这些图案包括宽度仅为70纳米的极细线条网格，以及间隙仅为25纳米的缝隙。在使用相同透镜的标准显微镜下，这些线条看起来只是一个模糊的灰色斑块，细节完全丢失。当研究人员开启新的扫描系统时，结果令人震惊。70纳米的线条呈现为清晰、锐利的脊状，且25纳米的间隙清晰可见。他们还在更复杂的形状上进行了测试，包括由仅50纳米宽的线条组成的火锅、灯笼和熊猫图案。虽然标准显微镜只显示出模糊的痕迹，但新系统却以惊人的清晰度揭示了每个形状的复杂细节。

这项工作的显著成就之一是能够在大面积范围内保持这种高水平的细节。许多超分辨率技术一次只能观察样本的一个微小区域，需要用户将数百张图像拼接起来才能看到全貌。然而，这种新方法捕捉到了一个110乘以110微米的宽广视野，同时仍能分辨出细至85纳米的线条。这意味着显微镜可以实时扫描大面积区域，为揭示的微小细节提供宏观背景。成像速度仅受限于相机的拍照速度，因此非常适合观察动态过程的发生。

为了证明该技术在活体生物组织上的有效性，研究人员使用了小鼠肾脏样本。他们聚焦于肾脏中一个被称为肾小球的微小过滤单元，其中包含一个由精细结构组成的网络，即系膜间隙。这些间隙非常微小，如果不进行特殊染色很难辨别。利用这种无标记系统，团队能够直接对肾脏组织进行成像。所得图像显示了系膜细胞之间细窄的间隙，其清晰度是传统显微技术无法比拟的。图像的强度剖面证实，该系统可以区分这些极其微小的间隙，而这些间隙在传统图像中是完全不可见的。这证明了该方法可以在无需任何化学染料或标记物的情况下，揭示活体组织的精细结构。

研究人员强调，他们的方法为超分辨率成像提供了一条简单直接的途径。与其他依赖复杂数学算法重建图像或需要可能损伤细胞的高强度光照的方法不同，该技术利用光的物理扫描特性来实现目标。它既适用于生物样本，也适用于非生物物体（如电子产品中的微芯片）。通过消除对荧光标记的需求，它为在自然状态下研究样本打开了大门，避免了染料可能引入的失真或毒性。这项工作预示了显微技术的一个新方向：只要引导得当，观察最小细节的能力将不再受传统光的限制。