Genetic decoupling of NINJ1-mediated cell lysis from developmental hydrocephalus reveals the physiological role of the α1 domain

Dentro ogni cellula vivente, una pelle protettiva chiamata membrana plasmatica funge da barriera vitale, mantenendo il macchinario interno della cellula al sicuro e separato dal mondo esterno. Quando una cella muore in un modo specifico e violento noto come piroptosi, questa pelle non viene solo danneggiata; viene frantumata. Questa rottura rilascia un'ondata di segnali interni che avvisano il sistema immunitario del pericolo, ma innesca anche una reazione a catena di infiammazione. Una proteina chiamata NINJ1 si trova sulla superficie di queste cellule e agisce come l'interruttore principale di questo frantumamento. Senza NINJ1, la membrana rimane intatta anche dopo che la cellula è morta, impedendo il rilascio di quei segnali infiammatori. Gli scienziati volevano da tempo studiare questo processo nei topi per capire come l'infiammazione guidi le malattie, ma c'era un grande ostacolo: i topi che mancano completamente della proteina NINJ1 spesso soffrono di una grave condizione cerebrale chiamata idrocefalia, in cui il fluido si accumula nel cranio, causando la morte di molti di loro prima che possano essere utilizzati nella ricerca. Ciò rendeva quasi impossibile allevare grandi gruppi di questi topi per esperimenti su larga scala.

Un team di ricercatori della Genentech e dell'Australian National University ha ora risolto questo problema creando un nuovo tipo di topo che si comporta come un topo carente di NINJ1 nella sua risposta immunitaria, ma cresce perfettamente sano. Si sono concentrati su una sezione specifica e piccola della proteina NINJ1, un segmento curvo vicino all'inizio della molecola noto come dominio alpha-1. Effettuando una modifica minima e precisa al codice genetico di questa sezione specifica, hanno creato un topo che non può rompere le proprie membrane cellulari quando muore, proprio come un topo che non ha affatto la proteina NINJ1. Tuttavia, a differenza dei topi privi di NINJ1, questi nuovi topi si sviluppano normalmente e non soffrono di idrocefalia. Questa scoperta dimostra che la parte della proteina responsabile della rottura delle cellule è diversa dalla parte necessaria per lo sviluppo cerebrale sano.

Per capire come abbiano ottenuto questo risultato, bisogna innanzitutto osservare come funziona la proteina NINJ1. In una cellula sana e vivente, la NINJ1 siede tranquillamente sulla superficie. Quando la cellula riceve un segnale di morte, la NINJ1 cambia forma e si assembla in lunghe e strette catene o filamenti. Questi filamenti agiscono come una cerniera o un cuneo che scinde la membrana cellulare, facendola esplodere. I ricercatori sapevano che un amminoacido specifico, un mattone fondamentale della proteina, situato alla posizione 45 all'interno di quel dominio alpha-1, era critico per questo assemblaggio. In esperimenti precedenti utilizzando cellule coltivate in una capsula di Petri, cambiare questo singolo mattone da una lisina a una glutammina impediva alla proteina di formare le catene necessarie per rompere la membrana. Il team ha deciso di testare se questa stessa modifica avrebbe funzionato in un intero animale vivente.

Hanno utilizzato uno strumento moderno di editing genico per introdurre esattamente questa modifica nel DNA degli embrioni di topo. Il risultato è stato una linea di topi, che hanno chiamato Ninj1K45Q, che portava questa specifica mutazione su entrambe le copie del loro gene. Quando i ricercatori hanno esaminato le cellule immunitarie di questi topi, hanno scoperto che le cellule apparivano e si comportavano normalmente. La proteina NINJ1 era presente sulla superficie nelle quantità corrette. Tuttavia, quando hanno attivato la morte delle cellule utilizzando vari metodi, come l'esposizione a tossine batteriche o sostanze chimiche che inducono la morte cellulare, le cellule si sono rifiutate di esplodere. Invece di rompersi e rilasciare il loro contenuto, le cellule si sono semplicemente rimpicciolite e sono rimaste integre. Ciò ha confermato che la mutazione aveva disabilitato con successo la capacità della proteina di rompere la membrana, imitando efficacemente l'effetto di avere nessuna proteina NINJ1.

I ricercatori hanno poi testato se questa mutazione influenzasse altre proteine correlate. Hanno esaminato la NINJ2, una proteina "cugina" che condivide una struttura e una sequenza simili. Alcuni studi precedenti avevano suggerito che anche la NINJ2 potesse giocare un ruolo nella rottura cellulare, forse agendo come backup o regolatore. Il team ha creato topi che mancavano completamente di NINJ2 e ha scoperto che questi topi non mostravano alcuna differenza nel modo in cui le loro cellule si rompevano rispetto ai topi normali. Anche rimuovendo sia NINJ1 che NINJ2, le cellule si comportavano esattamente come quando mancava solo NINJ1. Ciò ha escluso l'idea che la NINJ2 stesse aiutando a rompere le cellule in queste specifiche cellule immunitarie, confermando che NINJ1 è l'unico motore di questo processo in questo contesto.

La vera svolta, tuttavia, è arrivata quando i ricercatori hanno osservato la salute generale dei topi. I topi che mancano completamente della proteina NINJ1 hanno un problema ben documentato: circa la metà di loro muore poco dopo la nascita, e molti dei sopravvissuti presentano teste ingrandite a causa dell'accumulo di fluido nel cervello. Questa idrocefalia è stata un importante collo di bottiglia, che ha impedito agli scienziati di allevare il gran numero di topi necessari per studi complessi sulle malattie. Quando il team ha esaminato i loro nuovi topi Ninj1K45Q, i risultati sono stati sorprendenti. Questi topi sono nati nei numeri previsti, sono sopravvissuti fino all'età adulta e non hanno mostrato segni di idrocefalia o altre anomalie dello sviluppo. Le loro teste avevano dimensioni e forma normali.

Per assicurarsi che non fosse solo un caso fortuito, i ricercatori hanno testato i topi anche in un modello di lesione epatica. Hanno iniettato nei topi una sostanza che causa la morte delle cellule epatiche, un processo che normalmente porta a un massiccio rilascio di segnali infiammatori e danni al fegato nei topi standard. Nei nuovi topi mutanti, le cellule epatiche morivano, ma poiché la proteina NINJ1 non riusciva a rompere la membrana, i segnali infiammatori non venivano rilasciati. Di conseguenza, il danno epatico è stato significativamente ridotto. Questo ha dimostato che la mutazione ha interrotto con successo la cascata infiammatoria in un animale vivente, proprio come aveva fatto con le cellule in capsula di Petri.

I ricercatori hanno anche creato un secondo tipo di topo mutante per testare una parte diversa della proteina. Hanno cambiato un altro mattone, il triptofano alla posizione amente 29, che era stato precedentemente ritenuto coinvolto nel modo in cui le cellule si attaccano tra loro. Questi topi, chiamati Ninj1W29A, sono cresciuti anch'essi sani senza idrocefalia. Tuttavia, a differenza del primo gruppo, le loro cellule si rompevano comunque normalmente quando morivano. Questo ha comunicato ai ricercatori che il triptofano alla posizione 29 non è essenziale per la funzione di rottura della membrana, ma la lisina alla posizione 45 lo è.

Queste scoperte permettono agli scienziati di separare finalmente due compiti distinti che la NINJ1 svolge. Un compito è rompere la membrana cellulare per rilasciare segnali infiammatori, una funzione che richiede il dominio alpha-1 e la specifica lisina alla posizione 45. L'altro compito è garantire lo sviluppo cerebrale sano, una funzione che non richiede la capacità di rottura della membrana ma che si perde quando l'intera proteina viene meno. I nuovi topi Ninj1K45Q possiedono la funzione di rottura della membrana ma mantengono la funzione di sviluppo sano. Ciò significa che i ricercatori possono ora allevare grandi colonie di questi topi per studiare come la rottura cellulare guidi malattie come la sepsi, i disturbi autoimmuni o le infezioni, senza preoccuparsi che gli animali muoiano per idrocefalia o che i risultati siano distorti da difetti di sviluppo.

Lo studio ha anche chiarito il ruolo della proteina NINJ2. Dimostrando che i topi privi di NINJ2 non hanno problemi con la rottura cellulare, i ricercatori hanno fornito una forte prova del fatto che la NINJ2 non svolge un ruolo significativo in questo processo nelle cellule immunitarie, almeno nelle condizioni testate. Ciò aiuta a restringere l'attenzione per la ricerca futura, suggerendo che gli sforzi per comprendere la rottura cellulare debbano concentrarsi su NINJ1.

Nel quadro più ampio, questo lavoro fornisce un potente strumento per la comunità scientifica. Per anni, l'impossibilità di produrre grandi numeri di topi carenti di NINJ1 sani ha limitato l'ambito della ricerca sulle malattie infiammatorie. Il nuovo modello di topo rimuove questa barriera. Permette agli scienziati di studiare le conseguenze specifiche del blocco della rottura cellulare in un organismo vivente, senza il fattore confondente dei difetti di sviluppo cerebrale. I ricercatori hanno dimostrato che è possibile separare geneticamente il potere distruttivo della rottura cellulare dai processi essenziali dello sviluppo. Ciò apre la porta a indagini più precise su come funziona l'infiammazione e su come essa possa essere controllata, offrendo un percorso più chiaro verso la comprensione e il trattamento delle malattie in cui l'infiammazione incontrollata causa danni. Il lavoro è un chiaro esempio di come l'ingegneria genetica di precisione possa risolvere un problema pratico nella ricerca, trasformando un fenomeno biologico difficile da studiare in un sistema sperimentale gestibile e robusto.