A Severe COVID-19-associated hNTPDase2 Variant is Enzymatically Inactive

Nel mondo microscopico dei nostri corpi, le cellule comunicano costantemente utilizzando segnali chimici, alcuni dei quali sono costruiti da molecole chiamate nucleotidi. Tra questi, una molecola nota come ATP agisce come un potente segnale che può scatenare l'infiammazione, suonando essenzialmente un allarme per convocare il sistema immunitario in un sito di lesione o infezione. In circostanze normali, il corpo possiede una sofisticata squadra di pulizia composta da enzimi che degradano questi segnali una volta svolto il loro compito, impedendo all'allarme di suonare troppo forte o per troppo tempo. Uno di questi enzimi, chiamato hNTPDase2, si trova sulla superficie di certe cellule e agisce come un paio di forbici specializzate, tagliando a pezzi l'ATP e molecole simili per mantenerne i livelli sotto controllo. Quando questo sistema funziona correttamente, l'infiammazione è controllata e contenuta. Tuttavia, quando i livelli di queste molecole di segnalazione diventano troppo elevati, come si vede nei casi gravi di malattia respiratoria, la conseguente risposta immunitaria eccessiva può danneggiare i tessuti stessi che sta cercando di proteggere.

I ricercatori sanno da tempo che i pazienti che soffrono di forme gravi di COVID-19 mostrano spesso livelli pericolosamente alti di queste molecole di segnalazione extracellulari. Uno studio recente pubblicato da un team dell'Université Laval in Canada indaga una specifica variazione genetica trovata in alcuni di questi pazienti che potrebbe spiegare perché i loro corpi non siano riusciti a regolare questo processo. Gli scienziati si sono concentrati su un minuscolo errore nel codice genetico dell'enzima hNTPDase2, una mutazione che era stata segnalata nei database medici come potenzialmente dannosa. Ricreando questa specifica variante genetica in laboratorio, il team ha scoperto che la mutazione distrugge completamente la capacità dell'enzima di funzionare. Le loro scoperte suggeriscono che gli individui che portano questo difetto genetico mancano delle forbici molecolari necessarie per eliminare l'ATP in eccesso, lasciando potenzialmente le loro vie aeree in uno stato di infiammazione incontrollata che aggrava la gravità della malattia.

Lo studio è iniziato con un esame approfondito di una specifica sequenza genetica trovata in pazienti con COVID-19 grave. I ricercatori hanno identificato una singola lettera mancante nelle istruzioni del DNA per l'enzima hNTPDase2. Nel linguaggio della genetica, questa piccola delezione causa uno slittamento in come l'intera sequenza rimanente viene letta, molto simile a rimuovere una singola lettera da una frase e cambiare il significato di ogni parola che segue. Questo slittamento porta alla creazione di un segnale di stop prematuro, facendo sì che il corpo costruisca una proteina che è significativamente più corta della versione a lunghezza intera. Invece dei soliti 495 mattoni, o amminoacidi, la proteina mutata si ferma a 408. Questa troncamento è critico perché taglia via proprio la fine della proteina, rimuovendo una sezione nota come dominio transmembrana C-terminale e altre parti essenziali per il lavoro dell'enzima.

Per capire esattamente cosa significasse questo errore genetico per la funzione dell'enzima, gli scienziati hanno ricreato la mutazione in un ambiente di laboratorio. Hanno utilizzato una tecnica chiamata mutagenesi sito-diretta per introdurre la stessa identica delezione di una singola lettera in una sequenza di DNA che avevano clonato, creando una versione dell'enzima che hanno chiamato hN2COV. Hanno poi inserito questo codice genetico in cellule viventi, specificamente un tipo di linea cellulare di criceto spesso usata per la produzione di proteine, per vedere se le cellule costruirebbero l'enzima difettoso. Per assicurarsi di poter tracciare la proteina, hanno aggiunto un piccolo tag molecolare alla fine di entrambe le versioni, normale e mutata. Il team ha confermato che le cellule stavano effettivamente producendo l'mRNA delle istruzioni per la proteina mutata, provando che il codice genetico veniva letto. Tuttavia, quando hanno cercato la proteina effettiva utilizzando anticorpi progettati per riconoscere l'enzima normale, non l'hanno trovata. Ciò ha suggerito che la proteina mutata fosse instabile o strutturalmente così diversa da non essere riconosciuta dagli strumenti di rilevamento standard.

I ricercatori si sono poi rivolti a un metodo più diretto per vedere se l'enzima mutato potesse ancora svolgere il suo lavoro. Hanno misurato la capacità dell'enzima di scomporre ATP, ADP, UTP e UDP, le quattro molecole principali che dovrebbe elaborare. Utilizzando un test chimico standard che rileva il rilascio di fosfato quando queste molecole vengono scomposte, hanno confrontato le prestazioni dell'enzima normale contro la versione mutata. I risultati sono stati netti e definitivi. L'enzima normale scompone efficientemente ATP e UTP, proprio come previsto. Al contrario, l'hN2COV mutato non mostrava alcuna attività rilevabile. Era completamente incapace di scomporre alcuno dei quattro substrati. Ciò ha confermato che la mutazione non era solo un piccolo intoppo, ma una perdita totale di funzione, rendendo l'enzima inutile.

La ragione di questo fallimento totale risiede nelle parti specifiche della proteina che sono andate perdute. La coda mancante dell'enzima conteneva un amminoacido cruciale chiamato Cisteina 399, noto per formare un ponte chimico con un'altra parte della proteina per mantenerne la forma. Senza questo ponte, l'enzima non può ripiegarsi correttamente. La sezione mancante includeva anche un sito in cui vengono normalmente attaccate le molecole di zucchero, un processo essenziale per la piena attività dell'enzima, e altri residui che aiutano l'enzima ad agganciarsi alle sue molecole bersaglio. Il team ha notato che la mutazione ha sostituito la coda naturale mancante con una breve sequenza casuale di 18 nuovi amminoacidi che non appartengono a nessuna famiglia proteica nota, offrendo nessuna possibilità che l'enzima potesse acquisire una nuova funzione per compensare la perdita.

Le implicazioni di questa scoperta vanno oltre il banco di laboratorio. Sebbene l'enzima non si trovi nelle cellule del sangue che circolano in tutto il corpo, è presente nel rivestimento del tratto respiratorio, inclusi naso e bronchi. Questo è l'esatto luogo in cui il virus che causa il COVID-19 entra e attacca il corpo per la prima volta. In altre infezioni respiratorie, come l'influenza, alti livelli di ATP nelle vie aeree sono stati collegati a gonfiore severo e accumulo di liquidi. I ricercatori propongono che nei pazienti con questa specifica mutazione genetica, la mancanza di hNTPDase2 funzionale nelle vie aeree significhi che l'ATP in eccesso generato durante l'infezione virale non può essere rimosso. Questo accumulo probabilmente mantiene l'allarme immunitario che suona troppo forte, portando a una risposta infiammatoria più aggressiva e dannosa che contribuisce alla gravità della malattia.

Lo studio non afferma che questa mutazione sia l'unica causa del COVID-19 grave, né suggerisce che ogni paziente con sintomi gravi porti questo specifico difetto genetico. Invece, il lavoro fornisce una chiara spiegazione meccanicistica del perché la malattia possa essere più grave in un sottogruppo di individui. Dimostrando che questa variante è enzimaticamente inattiva, i ricercatori hanno identificato una potenziale vulnerabilità biologica. Le scoperte suggeriscono che la interruzione della segnalazione dei nucleotidi nelle vie aeree possa essere un fattore locale che aggrava la malattia, indicando un'area specifica in cui i meccanismi di difesa naturali del corpo sono venuti meno. Questa intuizione offre un quadro più chiaro del panorama biologico nei casi gravi e sottolinea l'importanza delle variazioni genetiche nel modo in cui gli individui rispondono alle infezioni respiratorie.