Precise templated editing using endogenous DNA polymerases
Il documento introduce THOR, una tecnologia basata su CRISPR-Cas9 che utilizza guide con code di DNA per reclutare le DNA polimerasi endogene per l'editing genomico preciso, privo di polimerasi esogene, attraverso diversi target e modelli cellulari.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Il genoma umano è spesso descritto come una vasta biblioteca di istruzioni, scritte in un codice chimico che detta come i nostri corpi crescono e funzionano. A volte, una singola lettera in questo codice è errata, portando a malattie. Per anni, gli scienziati hanno sviluppato strumenti per trovare e correggere questi errori, un campo noto come editing genomico. Il più famoso di questi strumenti agisce come un paio di forbici molecolari, tagliando il DNA in una posizione specifica. Una volta effettuato il taglio, il naturale meccanismo di riparazione della cellula interviene per ricucire i filamenti. Tuttavia, questo processo di riparazione naturale è spesso disordinato, portando a delezioni o inserzioni casuali che possono causare più danni che benefici. Per ottenere correzioni precise, in precedenza gli scienziati dovevano introdurre i propri enzimi specializzati per copiare un modello corretto direttamente sul DNA. Ciò aggiungeva uno strato di complessità, rendendo gli strumenti più grandi e difficili da consegnare nelle cellule. La domanda centrale per i ricercatori è stata se la macchina interna della cellula stessa, che utilizza ogni giorno per copiare e riparare il proprio materiale genetico, potesse essere indotta a eseguire questo compito di editing preciso senza la necessità di enzimi esterni aggiuntivi.
Un team di ricercatori di AstraZeneca e di istituzioni collaboratrici ha sviluppato un nuovo approccio chiamato THOR, che sta per Template Homology-Oriented Repair, per rispondere a questa domanda. Invece di fare affidamento su un enzima estraneo per copiare una correzione, questo metodo utilizza una molecola guida modificata che trasporta un breve pezzo di DNA attaccato alla sua estremità. Quando la guida trova il suo bersaglio nel genoma, crea un piccolo nick o un taglio. Il pezzo di DNA attaccato funge quindi da primer, invitando le proprie DNA polimerasi naturali della cellula — enzimi che la cellula possiede già e usa per la normale manutenzione — a legarsi e copiare l'edit desiderato dalla guida sul genoma. I ricercatori hanno dimostrato che questo sistema funziona efficacementamente nelle cellule umane, installando con successo cambiamenti genetici specifici in molteplici posizioni senza la necessità di fornire un enzima di copia esterno. Questa scoperta suggerisce che gli strumenti di riparazione interni della cellula sono sufficienti per eseguire un editing ad alta precisione se ricevono il giusto punto di partenza.
Il team ha testato questo concetto confrontando il loro nuovo sistema THOR con i metodi esistenti che si affidano alla trascrittasi inversa, un enzima che copia l'RNA in DNA. Nei loro esperimenti, hanno utilizzato cellule umane coltivate in laboratorio e hanno preso di mira diversi geni, inclusi quelli associati all'anemia falciforme. Hanno scoperto che il sistema THOR, che utilizza le proprie DNA polimerasi cellulari, poteva installare edit precisi con un livello di accuratezza paragonabile ai migliori strumenti esistenti. Fondamentalmente, poiché il sistema non richiede un complesso enzima esterno, la molecola guida è più semplice da fabbricare e confezionare. I ricercatori hanno anche osservato che questo metodo evitava un tipo specifico di sottoprodotto indesiderato visto in altri sistemi, in cui parti della molecola guida stessa vengono accidentalmente copiate nel genoma. Utilizzando una coda di DNA sulla guida, il sistema assicura che gli enzimi naturali della cellula smettano di copiare una volta raggiunto il termine dell'istruzione, prevenendo questi errori.
Ulteriori indagini hanno rivelato come il sistema si comporta in diverse condizioni e in diversi tipi di cellule. I ricercatori hanno testato il metodo nelle cellule staminali del sangue, che sono critiche per il trattamento dei disturbi del sangue, e hanno scoperto che la tecnica funzionava bene, specialmente quando le cellule venivano stimolate a crescere prima che l'editing avvenisse. Hanno anche esplorato se l'aggiunta di inibitori chimici potesse migliorare la qualità degli edit bloccando i percorsi di riparazione disordinati della cellula. Hanno scoperto che il blocco di determinati enzimi di riparazione aumentava la proporzione di edit precisi, rendendo il risultato più pulito. Tuttavia, hanno anche scoperto che il sistema non soffriva delle stesse limitazioni di altri strumenti riguardo alla disponibilità di componenti interni alla cellula, suggerendo che sia robusto in diversi ambienti cellulari. Il team ha anche testato la consegna del sistema utilizzando nanoparticelle lipidiche, minuscole bolle di grasso usate per trasportare materiale genetico nelle cellule, e ha confermato che il metodo rimane funzionale anche quando non viene iniettato direttamente nella cellula, sebbene l'efficienza fosse leggermente inferiore rispetto all'iniezione diretta.
Sebbene il nuovo metodo mostri grande promessa, i ricercatori hanno notato che non è un sostituto perfetto per tutti gli strumenti esistenti in ogni situazione. In alcune posizioni specifiche all'interno del genoma, il sistema era meno efficiente rispetto ad altri metodi, e le prestazioni variavano a seconda del tipo di edit effettuato. Lo studio suggerisce che il successo del metodo dipende fortemente dal design specifico della molecola guida e dall'interazione tra la guida e gli enzimi naturali della cellula. I ricercatori hanno anche indicato che la stabilità della molecola guida potrebbe essere migliorata per rendere il sistema ancora più efficace. Complessivamente, il lavoro stabilisce un nuovo percorso per l'editing genomico preciso che sfrutta la propria biologia cellulare piuttosto che combatterla. Dimostrando che le DNA polimerasi endogene possono essere dirette per eseguire un editing a template preciso, lo studio apre la porta a strumenti più semplici e versatili per correggere gli errori genetici, rendendo potenzialmente queste terapie più facili da sviluppare e somministrare in futuro.
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