Bacillus cereus MHI 86 and Bacillus thuringiensis 5-29 both produce the antilisterial bacteriocin thuricin S – analysis of antimicrobial spectrum, stability, and producer strain suitability, including cytotoxicity evaluation

La sicurezza alimentare si basa su un delicato equilibrio tra il mantenimento dei batteri nocivi a bada e la garanzia che i metodi utilizzati per fermarli non introducano nuovi pericoli. Per decenni, gli scienziati hanno cercato soluzioni nella natura, concentrandosi su un gruppo di sostanze chiamate batteriocine. Queste sono piccole proteine prodotte da determinati batteri per combattere i loro competitori. Pensatele come un sistema di difesa naturale, dove un microbo produce un'arma progettata specificamente per disabilitare un altro. Sebbene molte di queste sostanze siano ben note, quelle prodotte dalla famiglia di batteri Bacillus sono particolarmente interessanti perché questi microbi si trovano ovunque, dal suolo al cibo che mangiamo. Tuttavia, usarli come strumento richiede più del semplice trovare un batterio che uccida i germi cattivi; i ricercatori devono anche dimostrare che il produttore stesso sia sicuro e che l'arma che produce sia abbastanza forte da sopravvivere alle dure condizioni della lavorazione alimentare, come il calore e i cambiamenti di acidità.

In uno studio recente, i ricercatori si sono posti l'obiettivo di esaminare due ceppi specifici di batteri, uno della famiglia di Bacillus cereus e un altro della strettamente correlata famiglia Bacillus thuringiensis. Entrambi erano stati isolati originariamente da campioni alimentari e si sospettava che producessero una potente sostanza nota come thuricina S. Questa sostanza è famosa per la sua capacità di colpire Listeria monocytogenes, un patogeno pericoloso che può sopravvivere nei cibi refrigerati e causare gravi malattie. Il team voleva sapere se questi due diversi batteri stessero essenzialmente facendo la stessa cosa, come fabbricassero questa arma e se fosse abbastanza sicura per essere utilizzata nel mondo reale. Non si sono limitati a osservare se i batteri uccidessero altri germi; sono scesi in profondità nel codice genetico per vedere come fosse scritto il manuale di istruzioni per la produzione della sostanza, hanno misurato la dimensione esatta della proteina e hanno testato quanto resistesse al calore, all'acido e agli enzimi digestivi.

L'indagine è iniziata coltivando i due ceppi batterici in un liquido ricco di nutrienti e osservandoli nel tempo. I ricercatori hanno scoperto che entrambi i batteri iniziavano a produrre la loro sostanza antibatterica entrando in una fase di crescita rapida, con l'attività che diventava chiaramente rilevabile dopo otto ore. Un ceppo, Bacillus cereus MHI 86, mostrava un'attività leggermente più forte dell'altro, Bacillus thuringiensis 5–29, ma entrambi erano efficaci. Quando gli scienziati hanno misurato quanto fosse necessaria della sostanza per arrestare la crescita di Listeria, hanno scoperto che piccole quantità erano sufficienti. Il ceppo di B. cereus richiedeva circa 5,73 microgrammi per millilitro per fermare il patogeno, mentre il ceppo di B. thuringiensis ne richiedeva circa 10,77 microgrammi per millilitro. Per mettere questo in prospettiva, un antibiotico standard usato come confronto era efficace a una concentrazione di soli 0,20 microgrammi per millilitro, mostrando che, sebbene la batteriocina sia potente, non è così potente come alcuni farmaci tradizionali, pur offrendo un'alternativa naturale.

Per capire come questi batteri costruissero la loro arma, i ricercatori hanno esaminato i loro progetti genetici. Hanno scoperto che entrambi i ceppi possiedevano un set specifico di geni responsabili della produzione di thuricina S. Questi geni erano disposti in un modello ripetitivo, con tre copie della sequenza di istruzioni allineate una dopo l'altra. Questa disposizione è simile a quella osservata in altri batteri correlati, suggerendo una strategia evolutiva comune per la produzione di queste sostanze. Il team ha anche controllato quando questi geni venivano attivati. Hanno scoperto che i batteri producevano costantemente le istruzioni genetiche per la batteriocina a partire da otto ore di crescita, il che corrispondeva alla tempistica in cui l'attività antibatterica era stata osservata per la prima volta. Ciò ha confermato che i batteri stavano attivamente fabbricando la sostanza durante la loro fase di crescita, piuttosto che limitarsi a immagazzinarla.

Successivamente, i ricercatori dovevano confermare esattamente che aspetto avesse la sostanza e quanto pesasse. Hanno purificato la sostanza dal liquido in cui crescevano i batteri e l'hanno sottoposta a una serie di test. Un test, che separa le proteine in base alla dimensione, ha mostrato una banda distinta a circa 3,1 kilodalton, un'unità utilizzata per misurare la massa delle molecole. Per ottenere una misurazione più precisa, hanno utilizzato una macchina hi-tech che pesa le singole molecole. Questa analisi ha rivelato che la principale sostanza attiva aveva una massa di 3137,6 dalton. Questo peso specifico corrispondeva al profilo noto della thuricina S, confermando che entrambi i batteri stavano effettivamente producendo lo stesso tipo di arma. Hanno anche trovato una seconda versione della sostanza, leggermente più piccola, che potrebbe essere una variante o una forma leggermente alterata, ma l'ingrediente attivo primario era chiaramente identificato.

Il vero test per qualsiasi conservante alimentare è se possa sopravvivere alle condizioni che affronterà nel mondo reale. I ricercatori hanno sottoposto la sostanza purificata a vari stress. Hanno scoperto che rimaneva pienamente attiva in ambienti acidi e neutri, funzionando bene a livelli di pH che vanno da 3 a 7. Questo è fondamentale perché molti alimenti, come carni fermentate e formaggi, sono acidi. Hanno anche testato la resistenza al calore. La sostanza ha mantenuto oltre l'89 percento del suo potere di uccisione anche dopo essere stata riscaldata a 80 gradi Celsius, e manteneva ancora l'87 percento della sua attività dopo essere stata bollita a 100 gradi Celsius. Tuttavia, se la temperatura veniva alzata ai livelli estremi utilizzati per la sterilizzazione, intorno ai 121 gradi Celsius, l'attività diminuiva significativamente. Ciò suggerisce che, sebbene la sostanza sia resistente, non è indistruttibile e potrebbe essere utilizzata meglio in alimenti che non sono sottoposti alle temperature di sterilizzazione più elevate.

I ricercatori hanno anche controllato come la sostanza reagiva agli enzimi, che sono le proteine presenti nei nostri corpi e negli alimenti che degradano altre proteine. Quando hanno trattato la sostanza con enzimi come tripsina e chimotripsina, comuni nella digestione, essa è rimasta ampiamente attiva. Tuttavia, quando hanno utilizzato un enzima molto forte chiamato proteinasi K, la sostanza è stata completamente distrutta. Questo risultato ha confermato che l'arma è effettivamente una proteina, poiché è stata degradata dall'enzima progettato per consumare le proteine, ma era abbastanza robusta da resistere agli enzimi più blandi che potrebbe incontrare nel cibo o nell'intestino umano.

Forse la parte più critica dello studio era garantire che i batteri che producono questa arma fossero sicuri da usare. Bacillus cereus è una specie che può talvolta causare intossicazioni alimentari, quindi i ricercatori dovevano essere certi che questi ceppi specifici non producessero tossine nocive. Hanno testato i batteri per la produzione di enterotossina non emolitica, una tossina associata alla diarrea, e hanno scoperto che nessuno dei due ceppi produceva quantità rilevabili di essa, anche in condizioni che di solito incoraggiano la produzione di tossine. Inoltre, hanno testato la sicurezza del liquido batterico su cellule intestinali umane coltivate in laboratorio. Il liquido di entrambi i ceppi non ha causato danni alle cellule, mentre il liquido di un ceppo noto per essere tossico ha causato danni significativi. Questo profilo di sicurezza è essenziale, poiché significa che i batteri possono essere utilizzati per proteggere il cibo senza introdurre nuovi rischi per la salute.

Lo studio conclude che sia Bacillus cereus MHI 86 che Bacillus thuringiensis 5–29 sono ottimi candidati per la produzione di thuricina S. Essi generano una sostanza potente, stabile e sicura che può colpire efficacemente Listeria e altri batteri nocivi. Poiché la sostanza può resistere al calore e all'acidità, promette di essere utile per la conservazione degli alimenti, in particolare per quelli che vengono pastorizzati ma che potrebbero essere contaminati successivamente durante la lavorazione. La ricerca fornisce un quadro chiaro di come questi batteri creino la loro arma, come funzioni l'arma e perché sia sicura, offrendo un potenziale nuovo strumento per rendere la nostra catena alimentare più sicura senza fare affidamento esclusivamente sui tradizionali conservanti chimici.